目的:肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种严重威胁患者健康的运动神经元疾病,由复杂的环境、遗传因素等引起且作用机制不明确,没有有效的治疗药物。目前,大多研究应用动物或单个基因干预细胞株作为ALS疾病模型,但不能准确反映ALS的病理学特征。本研究首先应用皮肤组织,通过整合多种培养条件,优化成纤维细胞培养方法,以此建立本课题组体细胞培养、扩增流程,为后续快速、高效编程提供种子细胞。之后将采用优化方法获得的健康人和ALS患者的皮肤成纤维细胞重编程为i PSC,并进一步进行神经干细胞(NSC)定向分化。初步研究ALS患者与健康个体NSC分化比率的差异,为下一步ALS机制研究提供前期技术依据与实验证据。方法:1.取健康受试者无菌皮肤组织,将得到的皮肤组织均分为四份,采用四种不同的方法处理:(1)用0.25%的胰蛋白酶消化切碎的皮肤组织1h后直接种下含有细胞的悬液(try1h组);(2)0.25%胰蛋白酶消化皮肤组织0h(cut组);(3)0.25%胰蛋白酶消化皮肤组织1h(try1h-c组);(4)0.25%胰蛋白酶消化皮肤组织2h(try2h-c组);后三组消化后贴壁培养。2.用显微镜记录下组织或细胞每天的变化情况。比较每组细胞的出现时间、细胞形态以及细胞数量变化。3.用细胞免疫荧光、RT-PCR、Western-Blot和台盼蓝计数法等比较四组细胞的蛋白表达、增殖能力的差异;通过细胞划痕实验比较四组细胞的迁移愈合能力。4.采用以上优化方法获得的健康受试者和ALS患者的皮肤成纤维细胞,用重编程试剂盒将四种转录因子(h-Myc,Se V,KOS,Klf4)转入成纤维细胞,将成纤维细胞重编程为i PSC。5.应用RT-PCR、细胞免疫荧光、细胞流式等方法对i PSC的增值能力以及分化能力进行鉴定。6.将诱导得到的i PSC分化为NSC,并进行细胞免疫荧光染色,对比两组分化比率。结果:1.显微镜观察结果显示,四组中,经过0.25%胰蛋白酶消化2h后贴壁处理(try2h-c组)的组织,能够在组织微量的情况下在较短时间内成功分离出成纤维细胞,培养周期最短,成功率高。2.细胞免疫荧光,Western Blot和细胞划痕实验检测结果显示,优化方法分离出的成纤维细胞与传统方法分离的细胞在波形蛋白的表达、增殖能力和损伤愈合能力方面没有差异。3.重编程后,显微镜记录结果显示,细胞呈现典型的干细胞状态,能够传代增殖。4.细胞免疫荧光和细胞流式检测显示,诱导多能干细胞表达多能性蛋白,并且阳性率均在90%以上。细胞免疫荧光结果表明,i PSC能够分化为三胚层细胞,证明了i PSC的多项分化潜能。5.iPSC经分化后,表现出NSC的典型形态,并且免疫荧光检测结果显示NSC特异性蛋白为强阳性。6.通过计算NSC的阳性蛋白表达率,表明健康和ALS患者i PSC向NSC分化的比率没有显著统计学差异。结论:1.通过比较,用0.25%胰蛋白酶消化2h(try2h-c组)的处理方法可在最短时间内从极微量的皮肤组织中成功分离出足够数量的成纤维细胞,是目前最为经济高效且组织利用率和成功率高的培养方法。2.经过优化方法分离培养出来的成纤维细胞可以重编程为与成纤维细胞同一来源且无毒性的i PSC,具有增殖能力以及多项分化潜能,为进一步进行NSC的分化提供基础。3.经过小分子诱导剂的培养,iPSC能够成功分化为NSC,并且疾病和健康的细胞的分化比率没有显著的统计学差异。