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香雪兰(Freesia hybrida),花色丰富,品系众多,是研究花色代谢的良好材料。类黄酮是形成植物花色的主要因素之一。类黄酮有很多生物学功能,而影响类黄酮的因素也很多,多个结构基因、调节基因、以及环境因子都能改变类黄酮的种类和含量,进而改变花色。査尔酮异构酶是植物类黄酮合成途径中的第二个关键酶。研究发现,査尔酮异构酶基因在花色形成、类黄酮合成中起着重要作用。本论文以香雪兰査尔酮异构酶基因(FhCHI)为研究对象,克隆到FhCHIs基因家族,并通过原核表达和真核表达分析其功能的差异;希望确定香雪兰中与类黄酮合成直接相关的FhCHIs,为通过植物基因工程改良花色提供理论基础。主要实验结果如下:1.香雪兰查尔酮异构酶基因家族(FHCHIs)的克隆及其序列分析。根据已知的香雪兰转录组测序结果及简并引物PCR得到的片段,共克隆到5个香雪兰査尔酮异构酶基因(FHCHIs)的cDNA和基因组全长。FhCHI1~FhCHI5 cDNA的开放阅读框碱基数分别为687、771、771、630、834 bp,分别编码228、256、256、209、277个氨基酸。它们分别与郁金香、中国水仙、海枣、荷兰鸢尾、中国水仙中的CHI同源性最高。其中相应的蛋白质FhCHI1、FhCHI2、FhCHI5存在五个保守的活性位点氨基酸,FhCHI3、FhCHI4则不存在。系统进化分析显示,FhCHI1、FhCHI2、FhCHI5归于Ⅰ型CHI,FhCHI3、FhCHI4则分别归于Ⅲ型、Ⅳ型CHI。2.FHCHIs的表达模式分析。在花开放的5个时期,FhCHI1、FhCHI3、FhCHI4的表达模式类似,在红绿间时期达到最高;而FhCHI2、FhCHI5的表达量在初开时期达到最低后,在盛开时期又有所回升。在不同组织中,FhCHI1~FhCHI5均在花托和花瓣中表达量最高;而且FhCHI1和FhCHI3的总体表达量相对较低。3.FHCHIs原核表达蛋白的制备和体外酶活检测。首先构建了原核表达载体pET28a-FhCHIs;再转入大肠杆菌表达菌株BL21中,通过体外低温诱导,大量制备并经过镍柱纯化得到原核表达蛋白;然后通过HPLC检测酶促催化产物。结果显示,FhCHI2、FhCHI5能以柚皮素査尔酮为底物,催化生成柚皮素,而FhCHI3、FhCHI4则没有该活性。而FhCHI1没有得到可溶性蛋白。4.FHCHIs的真核异源表达。成功构建真核表达载体pBI121-FhCHIs后,转基因进入拟南芥CHI突变体中,并筛选到阳性植株。发现FhCHI1、FhCHI2、FhCHI5的转基因植株幼苗,其生长点恢复为紫色的表型,种皮颜色也恢复成棕色;而FhCHI3、FhCHI4的转基因植株没有这些表型恢复。通过HPLC检测转基因植株的花色苷和黄酮醇含量,发现FhCHI1、FhCHI2、FhCHI5的转基因拟南芥植株都部分恢复了花色苷和黄酮醇的代谢;而FhCHI3、FhCHI4则没有使拟南芥CHI突变体恢复花色苷和黄酮醇的代谢。实验结果证明:FhCHI1、FhCHI2、FhCHI5基因与香雪兰类黄酮合成直接相关。