论文部分内容阅读
研究背景:2000多年来中医药广泛应用于疾病的预防和治疗。脑出血疾病发病凶残,病情变化快,致死致残率高,严重威胁国民生命和生活质量。目前国际上针对该疾病明确有效的治疗方式尚无公论,为了找到更为有效的治疗方法,脑出血的发病机制仍需要作深入研究。中药复方治疗疾病具有多成分多靶点多通路的特点,具有系统整体地改善疾病的先天优势。已有研究表明凉血通瘀方能通过多种通路发挥治疗急性脑出血的药物效应作用。但目前在分子水平上系统地研究中药方剂的科学基础仍然是一个巨大的挑战,我们综合采用网络药理学方法、转录组学和WGCNA方法研究急性脑出血的分子病理机制和凉血通瘀方治疗脑出血疾病的药效机理。第一部分基于RNA-seq研究急性脑出血发病的分子病理机制目的:深入研究脑出血疾病发病过程中关键的mRNA和lncRNA调控因子,以及受影响的信号通路,同时全面分析基因表达量方差大变异较大的基因,构建加权基因共表达网络,揭示脑出血发病的分子病理机制。方法:胶原酶对高血压大鼠SHR造脑出血疾病模型,给药组给药凉血通瘀方治疗,设置4个实验组即正常SHR组(CG)、正常SHR给药凉血通瘀方组(EG 1)、脑出血SHR组(EG2)、脑出血给药凉血通瘀方组(EG3),检测4个实验组脑组织样本的RNA-seq数据。首先分析EG2组和CG组样本显著差异表达的基因,初步分析受脑出血疾病影响的信号通路;再用WGCNA方法对4个实验组所有样本中方差大变异较大的基因构建加权基因共表达网络,全面分析基因间的相互作用关系和共表达调控模式;Cytohubba插件分析该网络找出脑出血发病病程中关键的mRNA和lncRNA,并预测相关lncRNA的功能;最后将模块基因与实验分组特征进行关联分析,找出与脑出血疾病相关性强且具有统计学意义的基因表达模块,分析这些模块的功能,基于基因水平揭示脑出血发病的分子病理机制。结果:1.分析EG2组和CG组显著差异表达基因,初步发现脑出血疾病最大可能干扰的前5个通路是IL-17信号通路、趋化因子信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路;2.WGCNA方法对4个实验组样本中表达量方差大的基因构建加权基因共表达网络,分析得到脑出血发病病程中7个关键mRNA为Ccl7、Resp18、Steap4、Sparc、Clic4、Ptx3、Stxla 和 5 个关键 lncRNA 为 MSTRG.7544.7、ENSRNOT00000091284、ENSRNOT00000076965、MSTRG.7544.5、MSTRG.1053.1。5 个关键 lncRNA 中有 3 个lncRNA之间有共表达调控关系。此5个lncRNA可能主要参与神经活性配体-受体相互作用、糖酵解/糖异生、柠檬酸盐循环(TCA循环),甘油脂代谢、鞘脂代谢、胆固醇代谢、丙酮酸代谢、β-丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、醛固酮调节钠的重吸收、NOD样受体信号通路、IL-17信号通路和凋亡通路,涉及到能量代谢、细胞凋亡、血压调节、脂质代谢、蛋白质代谢、炎症反应、免疫应答等多方面调控过程,在脑出血疾病发生机制中起重要作用;3.将模块基因与实验分组特征关联分析,发现与脑出血疾病相关性强且具有统计学意义的模块有6个。其中正相关调控的4个模块有pink、skyblue3、darkred和sienna3模块,分别与P13K-Akt信号通路、嘌呤代谢、IL-17信号通路、MAPK信号通路相关;负相关调控的2个模块有saddlebrown和darkgrey模块,分别与心肌中肾上腺素的信号传导、MAPK信号通路和Toll样受体信号通路。这些极大影响脑出血发病机制中的细胞增殖与凋亡、炎症反应、免疫应答等方面。结论:脑出血发病具有复杂的分子紊乱病理机制,lncRNA和mRNA都在其中有重要作用,多个信号通路尤其是MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路被调控,涉及到细胞增殖与凋亡、炎症反应、免疫应答等多方面。第二部分凉血通瘀方治疗急性脑出血的网络药理学作用机制目的:深入分析并验证凉血通瘀方治疗脑出血疾病的关键成分、靶点和通路,构建中药-成分-靶点-通路网络,探究凉血通瘀方的多成分、多效应药理机制。方法:应用网络药理学找出凉血通瘀方治疗脑出血疾病的有效成分和潜在靶点,构建活性成分-靶点网络,找出关键的活性化合物和关键靶点;用PPI网络探究潜在靶点间的蛋白-蛋白相互作用关系;R语言程序包对潜在靶点进行GO功能和KEGG通路分析。用胶原酶造SHR脑出血模型组(EG2),给药形成凉血通瘀方治疗组(EG3),检测该两组脑组织样本的RNA-seq数据并分析显著差异表达的基因;对照网络药理学方法得到的潜在靶点和显著差异表达基因,验证出凉血通瘀方治疗脑出血疾病的重要基因;对显著差异表达基因构建PPI网络,并用KOBAS对差异基因进行GO功能和KEGG通路富集,找出凉血通瘀方治疗脑出血疾病所调控的相关通路,说明其成分和多效应药理机制;最后结合第一部分的WGCNA模块基因与实验分组特征关联分析,全面分析表达基因,找出与凉血通瘀方治疗相关性强且具有统计学意义的基因表达模块,分析这些模块的功能,揭示凉血通瘀方治疗脑出血疾病的多成分、多效应药理机制。结果:1.本研究应用网络药理学方法找出凉血通瘀方治疗脑出血疾病的76种有效成分(槲皮素、丙氨酸、山奈酚等)和376个潜在靶点(PTGS2、PTGS1、ESR1等)。凉血通瘀方治疗脑出血疾病的活性成分-靶点网络显示,牡丹皮/三七的槲皮素、水牛角的丙氨酸和牡丹皮/石菖蒲的山奈酚成分作用的靶点数目最多,它们可能是关键的活性化合物,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用。拓扑参数评估结果显示凉血通瘀方治疗脑出血的所有潜在靶点中,PTGS2、Bax、TNF、JUN、IL1B和NOS2都是重要靶点。PPI网络结果显示靶点STAT3在蛋白质-蛋白质相互作用中有重要作用。网络药理学收集的潜在靶点显著富集到72个KEGG信号通路,其中MAPK和PI3K-Akt信号通路富集到的基因数目最多,是凉血通瘀方治疗脑出血疾病最可能调控的信号通路;2.分析模型组EG2和给药组EG3的RNA-seq数据中显著差异表达的基因,对照网络药理学方法得到的376个潜在靶点我们验证出14个重要基因。其中PTEN、CTH、PTGS2、PTAFR、FOS、NOS1这6个基因表达量上调,NOS2、PGR、MMP3、PON1、NEDD4、ACADSB、KL、CASP3这8个表达基因量下调。显著差异表达基因的富集分析结果也显示凉血通瘀方治疗脑出血疾病主要通过调节MAPK信号通路、Ca2+信号通路、细胞凋亡、TNF等信号通路,发挥其抗氧化、抗炎、抗凋亡和降低血压的药理作用;3.用WGCNA方法分析4个实验组样本中表达量方差大的基因,将模块基因与实验分组特征关联可发现与凉血通瘀方给药治疗相关性强且具有统计学意义的模块有2个模块:darkgrey和white,且为负相关调控,它们分别与心肌中肾上腺素的信号传导、MAPK信号通路、甘油磷脂代谢、磷酸肌醇代谢和氧化磷酸化相关,在脑出血疾病治疗相关的细胞增殖和凋亡、脂质代谢、抗氧化和抗炎等方面有重要调节作用。结论:凉血通瘀方发挥了多种药效机制来治疗急性脑出血,多个信号通路被调控,涉及到细胞增殖和凋亡、脂质代谢、抗氧化和抗炎等多方面,MAPK信号通路也是凉血通瘀方治疗脑出血疾病最可能调控的信号通路。