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人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是世界公认的最普遍的引起性传播疾病的病原,与多种恶性肿瘤的发生有密切关联,95%的宫颈癌都是HPV感染导致的。研究发现,HPV感染导致肿瘤发生,主要是由于其E6、E7基因整合到宿主细胞基因组,其表达的蛋白与肿瘤细胞的生长具有重要影响。因此E6和E7成为HPV相关肿瘤免疫治疗领域中广泛关注的重要抗原。近年来,通过靶向E6和E7并杀伤表达E6/E7肿瘤细胞的T细胞免疫疗法,已经成为治疗HPV相关肿瘤的重要研究方向。HLA-A11是中国人群频率较高的HLA-A位点多态性基因,然而目前尚未鉴定出HPV特异性的HLA-A11限制性T细胞表位,为HPV相关肿瘤的免疫治疗带来了一定局限性。本论文主要的主要研究内容在于鉴定HPV E6/E7抗原HLA-A11限制性T细胞表位及T细胞受体(TCR),为HPV相关肿瘤的免疫治疗提供基础。研究筛选鉴定了HLA-A11限制性的E6、E7抗原的T细胞表位,筛选出了相关抗原表位的特异性T细胞受体(TCR)。取得的主要结果包括:(1)生物信息学预测HLA-A11限制性E6、E7表位:利用表位数据库网站IEDB(www.iedb.org),预测出10条HLA-A11限制性多肽。其中,E6有9条,E7有1条。(2)表位鉴定及特异性T细胞检测:合成预测的10条多肽,将合成的多肽混合,随后和CTL免疫佐剂混合注射到HLA-A11转基因小鼠腹部皮下,每周一次,共三次,第四周取样。采用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)技术,鉴定出2条E6多肽具有阳性反应,分别是HPV-E6-A11-08和HPV-E6-A11-09。一条E7多肽呈阳性,HPV-E7-A11-01。(3)特异性T细胞分选及单细胞测序:根据ELISPOT的结果,将三条阳性多肽分别与HLA-A11/β2m包涵体进行体外复性。结果显示,这三条多肽都能与HLA-A11/β2m体外形成MHC复合物。将MHC复合物蛋白制成tetramer,用于流式分选表位特异性T细胞。分选结果显示,HPV-E6-A11-09多肽制成的tetramer分选出明显阳性细胞群,另外两条肽无明显阳性细胞群。通过单细胞测序技术,测出每个单细胞的TCR序列。根据序列频率,从2只小鼠的淋巴细胞中筛选出4个鼠源TCR序列。(4)TCR表达载体构建及流式鉴定:单细胞测序得到的TCR序列,分析得到每个TCR序列的α链和β链的V区,分别将鼠源α链和β链的V区和人源TCRα链和β链的C区构建到一起,形成一个新的TCR的α链和β链,α链和β链以一段linker连接。随后将改造的TCR构建到p CDH＿EF1＿MCS＿T2A＿puro载体上。将构建好的4个TCR表达载体分别和CD3/CD8质粒共转染到293T细胞。使用HPV-E6-A11-09多肽制成的tetramer流式鉴定。结果显示,构建的4个TCR都能在293T细胞上表达,并与E6-9-tetramer特异性结合。总之,本研究初步鉴定出了HPV E6和E7抗原特异性的HLA-A11限制性T细胞表位,并通过转基因小鼠免疫,筛选获得了表位特异性TCR。进一步将通过功能实验对这些TCR对靶细胞的细胞因子反应能力及肿瘤抑制活性进行评价。这些研究和发现为HPV相关肿瘤的免疫治疗提供了重要基础。