一.研究背景:　　 1.探究预测转移机制是影响结肠癌肝转移预后的关键因素。　　 结肠癌是消化系统常见恶性肿瘤，发病率占胃肠道肿瘤的第3位。近年来由于医疗水平的进步多数患者得以在早期发现并进行相应治疗，然而即使在早期切除原发肿瘤后，大约40％的患者在5年内出现腹腔复发和肝转移，而且其发病率逐年上升[1]。Tsai等[2]研究发现结肠癌同时伴有肝转移行同期肝切除手术5年生存率只有16.8％。化疗（肝灌注化疗）因为靶向性不高，对正常组织损伤较大，对患者长期生存无显著改善作用。冷冻消融和射频消融对杀灭肿瘤细胞有确切效果，但其是否可以延长总体的生存时间，尚未有明确结论。目前认为，结肠癌肝转移的过程包括细胞外基质(ECM)的降解、细胞黏附性能的改变、肿瘤细胞局部浸润、肿瘤血管生成、肿瘤细胞循环内播散和免疫逃逸、肿瘤细胞血管内栓塞及肿瘤细胞在新的微环境重新生长等几方面[3，4]。寻找更为有效的干预方法及探究预测转移机制是解决问题的关键所在。　　 2.目前血管生成在结肠癌肝转移中的研究现状　　 在肿瘤形成及转移过程中，肿瘤血管生成起了非常重要的作用。肿瘤的一个亚群细胞转换为有血管生成基因的表型(an angiogenic phenotype)后，新生血管就开始迅速生成，肿瘤将进一步生长并发生转移[5]。Strieter提出在恶性肿瘤的生长和发展过程中存在血管生成因子及血管稳定因子之间的失衡[6]。肿瘤细胞可以通过过度表达一种或多种正性的血管生成调节因子、促使细胞间质含有的血管生成蛋白的释放、促宿主相关细胞释放其内的血管生成因子等方式来促进局部血管生成。促肿瘤血管生成的最重要的因子是血管内皮生长因子(VEGF)。在结肠癌，VEGF是影响结肠癌肝转移的重要因素[7]。除了VEGF外，血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)在结肠癌的血管生成过程中也有重要作用。PD-ECGF是一种促血管生成因子，在低VEGF表达的富含血管生成的结肠癌中，PD-ECGF可能有重要作用。　　 血管生成拟态是一种与经典肿瘤血管生成途径不同，不依赖于机体内皮细胞的全新肿瘤微循环模式。在血管生成方面，既往对结肠癌肝转移的研究集中在肿瘤血管密度的增加和血管因子的生成方面。但血管生成拟态的形成是否和结肠癌转移有关，目前无系统研究。　　 3.I-TAC—CXCR3诱导血管生成的研究现状　　 趋化因子的主要作用是趋化细胞的迁移，细胞沿着趋化因子浓度增加的信号向趋化因子源处迁徙。最近研究发现，趋化因子作为肿瘤微环境中关键信号分子，在肿瘤的侵袭及转移中起着重要的作用。1998年首次证实βR-1基因编码的产物为趋化因子I-TAC，编码基因位于人染色体4q21.2。由94个氨基酸组成（包括21氨基酸信号序列），成熟I-TAC由73个氨基酸组成，分子量约为8300[8]，属于ELRCXC趋化因子家族。I-TAC受体为CXCR3，由368个氨基酸组成，其编码基因位于人染色体Xq13。CXCR3分子结构中含有7个富含巯基氨基酸的α螺旋穿膜区，属于7次跨膜转运G蛋白偶联受体超家族，经异源三聚体G蛋白传递信号。CXCR3不仅是I-TAC的受体，也是Mig、IP-10的受体。其主要分布在Th1细胞和B细胞，NK细胞和EC也有表达[9]。在血管生成方面，I-TAC可以作为血管生成或抗血管生成的因子，而且I-TAC和CXCR3还可以与VEGF相互协同作用。癌细胞可以直接产生I-TAC，也可以通过调控周围的炎症细胞来释放I-TAC进行血管生成的调控。此外，CXCR3还可以直接调控细胞的凋亡[10]。趋化因子I-TAC血管调控作用同CXCR3的结合是相关联的[11]。　　 目前研究指出，I-TAC—CXCR3不但介导癌细胞的定向移动，还参与了包括穿入血管，锚定，穿出血管，免疫逃逸，增殖并血管生成等每个过程[12]。在胃癌手术切除标本中发现肿瘤组织CXCR3表达明显高于相应癌旁组织，胃癌细胞系CXCR3也升高[13]。推断CXCR3及其配体以协同作用的方式与粘附分子合作来决定肿瘤细胞的侵袭及增殖能力。研究报道肾癌[14]和黑色素瘤[15]细胞可表达CXCR3，并通过与其配体作用，介导癌细胞的定向移动和增殖。在小鼠模型中，如提高CXCL9和CXCL10的水平，高转移黑色素瘤细胞系B16F10的转移能力可再提高3倍，而使用反义RNA降低B16F10细胞的CXCR3表达，或者使用抗体中和CXCL9和CXCL10的作用，则该细胞几乎失去转移能力[16]。血管生成是生成新血管、修复损伤血管的生理和病理过程。这个过程受到促血管生成因子和抑制血管生成因子的调控。　　 我们提出以下问题:I-TAC—CXCR3是否诱导结肠癌肝转移，血管生成拟态在结肠癌肝转移中的作用如何？I-TAC—CXCR3诱导血管生成拟态形成是否是结肠癌肝转移机制之一？　　 综上所述，本研究拟:(1)应用免疫组化方法检测结肠癌肝转移病人结肠肿瘤和肝脏转移瘤的I-TAC—CXCR3表达;应用PAS染色、CD31双重染色检测结肠癌组织及肝转移瘤中血管生成拟态的表达，并分析其与结肠癌临床病理参数的关系，证实I-TAC—CXCR3及血管生成拟态在结肠癌肝转移中的作用;(2)应用RT-PCR和Westernblot检测结肠癌肝转移细胞株中CXCR3及蛋白的表达水平:构建表达CXCR3的质粒载体，并稳定转染肿瘤细胞，进而检测I-TAC—CXCR3对肿瘤细胞体外增殖、迁移能力及侵袭能力的影响。若实验证实肝转移组与无肝脏转移组结肠癌中I-TAC—CXCR3及血管生成拟态表达差异，且与结肠癌淋巴结转移率、分化程度等临床病理参数具有相关性;而且证实I-TAC—CXCR3通过血管生成拟态诱导结肠癌肝转移是其机制之一。那么，应用I-TAC—CXCR3及血管生成拟态对肿瘤进行检测，就建立了结肠癌肝转移的预测机制，沉默CXCR3为在结肠癌可能转移的早期进行干预、进一步降低转移率提供理论支持。　　 二.研究目的：　　 1.临床研究方面:应用免疫组化方法检测结肠癌肝转移病人结肠肿瘤和肝脏转移瘤的I-TAC—CXCR3表达;应用PAS染色/CD31双重染色检测结肠癌组织血管生成拟态的表达，并分析其与结肠癌临床病理参数的关系，证实I-TAC—CXCR3及血管生成拟态在结肠癌肝转移中的作用;　　 2.细胞研究方面:应用RT-PCR和Westernblot检测结肠癌肝转移细胞株中CXCR3及蛋白的表达水平;构建表达CXCR3的质粒载体，并稳定转染肿瘤细胞，进而检测I-TAC—CXCR3对肿瘤细胞体外增殖、迁移能力及侵袭能力的影响。　　 三.研究方法：　　 (1)临床研究　　 1.收集结肠癌肝转移所行结肠癌根治合并肝转移瘤切除病人22例;选取20例结肠癌无肝转移为对照组。收集结肠癌及肝转移瘤组织。所有标本取材后分别保存。　　 2.免疫组织化学测定I-TAC—CXCR3在结肠癌组织、肝转移瘤组织中的表达。　　 3.应用PAS及CD31双重染色检测结肠癌组织中血管生成拟态的表达，PAS染色阳性、CD31抗体检测阴性为血管生成拟态形成。　　 (2)细胞研究　　 1.CXCR3质粒载体的构建和鉴定，转染至肿瘤细胞和表达检测:从人结肠癌组织中提取总RNA，采用RT-PCR方法得到全长CXCR3cDNA片段，并稳定转染肿瘤细胞，经筛选后应用PCR进行鉴定。　　 2.实验分组:(1)pEGFP组;(2)CXCR3组;(3)pEGFP+I-TAC组;(4)CXCR3+I-TAC组　　 3.应用RT-PCR和Westernblot检测结肠癌肝转移细胞株中CXCR3mRNA及蛋白的表达水平。　　 4.从体外细胞模型观察I-TAC的存在与否对CXCR3细胞和pEGFP细胞增殖、定向迁移及侵袭能力的差异，探讨I-TAC-CXCR3结肠癌肝转移细胞增殖、定向迁移和侵袭中的作用。　　 四.研究结果：　　 （一）临床研究:　　 结肠癌肝转移组共22例病人（每例取结肠癌及肝转移病灶组织各一块），共44个组织样本。结肠癌无肝转移组共20例病人（每例取结肠癌组织各一块），共20个组织样本。　　 1.CXCR3在42例结肠癌组织中表达:肝转移组16例阳性表达，阳性率72.72％,　　 6例阴性表达，无肝转移组7例阳性表达，阳性率35％，13例阴性表达。与无肝转移组比较差异有统计学意义(x2＝6.019，P＝0.014)。　　 2.I-TAC在42例结肠癌组织中表达:肝转移组19例阳性表达，阳性率86.36％,　　 3例阴性表达，无肝转移组9例阳性表达，阳性率45.00％，11例阴性表达。与无肝转移组比较差异有统计学意义(x2＝8.066，P＝0.005)。　　 3.肝转移组CXCR3在22例结肠癌组织及肝内转移癌组织中的表达:结肠癌组织中有16例表达阳性，阳性率72.72％，6例阴性表达，肝转移癌组织中16例阳性表达，阳性率72.72％，6例阴性表达。两组比较差异无统计学意义(x2＝0.000，P＝1.000)。　　 4.肝转移组ITAC在结肠癌组织及肝内转移癌组织中的表达:结肠癌组织中有19例表达阳性，阳性率86.36％，3例阴性表达，肝转移癌组织中19例阳性表达，阳性率86.36％，3例阴性表达。两组比较差异无统计学意义(x2＝0.000，P＝1.000)。　　 5.结肠癌细胞中VM的表达:VM在22例肝转移组结肠癌组织中有14例阳性表达，阳性率为63.63％，8例阴性表达。无肝转移组结肠癌组织中有5例阳性表达，阳性率为25.00％，15例阴性表达，与无肝转移组比较差异有统计学意义（x2＝6.313，P＝0.012）。　　 6.分析42例入组病人实验结果，发现23例CXCR3阳性病例中ITAC均为阳性;19例VM阳性病例中CXCR3均为阳性。统计结果进行配对资料的相关性分析，CXCR3与ITAC两者阳性表达呈正相关（相关系数r＝0.614，P＜0.001），血管生成拟态(VM)与CXCR3两者阳性表达呈正相关(相关系数r＝0.637，P＜0.001)。（详见表6、7）　　 7.CXCR3表达与结肠癌组织临床病理特征的关系:CXCR3阳性表达主要定位于细胞膜，少数表达于细胞浆和细胞核。按CXCR3阳性细胞率和着色强度对结肠癌标本进行记分，结果显示CXCR3在结肠癌组织中的表达水平不一，CXCR3的高表达与结肠癌患者的年龄、性别、结肠癌组织分化程度无关，而与肝脏、淋巴结转移有关。　　 （二）细胞研究:　　 1.CXCR3蛋白表达情况:在培养的原代结肠癌肝转移细胞株中CXCR3基因表达阳性，并可以在蛋白质水平上被检测到。三组细胞（细胞组pGFP-CXCR3;pGFP;未转化的QBC939细胞）均有CXCR3基因在RNA水平上的阳性表达，且RNA量上的规律是:细胞组pGFP-CXCR3＞细胞组pGFP＞自细胞组未转化的QBC939细胞。但差异无统计学意义，很有可能蛋白CXCR3的表达量是更多的受到翻译后调控。　　 2.I-TAC—CXCR3对肿瘤细胞体外贴壁增殖的影响（WST-1法）　　 在同样的体外培养条件下，细胞组pGFP-CXCR3体外贴壁增殖能力是三个细胞组中最强的;其次为未转化QBC939细胞;最差的为转化pGFP的细胞组。　　 3.I-TAC—CXCR3对肿瘤细胞体外迁移能力的影响　　 在同时有CXCR3蛋白和ITAC蛋白的体外培养的条件下QBC939的体外迁徙能力最强，在缺乏CXCR3和ITAC蛋白的体外培养条件下，细胞QBC939的体外迁徙能力最弱。　　 4.Transwell迁移实验检测情况:pGFP-CXCR3结肠癌细胞组在趋化作用下发生体外迁移细胞明显增多，pGFP结肠癌细胞组体外迁移则明显少。　　 五.研究结论:　　 （一）临床研究　　 1.I-TAC-CXCR3在结肠癌及肝转移瘤中高表达，支持I-TAC-CXCR3与结肠癌肝转移有相关性。I-TAC-CXCR3信号转导通路可能在结肠癌肝转移过程中起一定作用.　　 2.结肠癌组织中存在血管生成拟态。在肝转移组结肠癌组织中血管生成拟态高表达，说明血管生成拟态与肝转移有相关性。　　 3.CXCR3与血管生成拟态阳性表达呈正相关，I-TAC-CXCR3可能诱导了血管生成拟态形成。　　 （二）细胞研究　　 1.本实验从原代的结肠癌肝转移细胞株检测到CXCR3基因在RNA水平和蛋白质水平上都有表达。　　 2.利用SMARTRACE的方法调取CXCR3基因，得到全长cDNA并构建载体pGFP-CXCR3和pGFP。成功转化QBC939细胞得到细胞株pGPF-CXCR3和细胞株pGPF-CXCR3。　　 3.通过Real-timePCR法检测，结果表明三组细胞都有CXCR3基因在RNA水平上的表达，且RNA量上的规律是:细胞组pGFP-CXCR3＞细胞组pGFP＞自细胞组未转化的QBC939细胞，但差异无统计学意义。很有可能蛋白CXCR3的表达量是更多的受到翻译后调控。　　 4.WST-1法检测细胞体外贴壁增殖能力。在同样的体外培养条件下，细胞组pGPF-CXCR3体外贴壁增殖能力是三个细胞组中最强的;其次为未转化QBC939细胞;最差的为转化pGFP的细胞组。说明趋化因子受体CXCR3对细胞贴壁增殖起促进作用。　　 5.Transwell实验表明趋化因子受体CXCR3对细胞的侵袭能力有促进作用。　　 6.另一组实验表明在同时有CXCR3蛋白和ITAC蛋白的体外培养的条件下QBC939的体外迁徙能力最强，在缺乏CXCR3和ITAC蛋白的体外培养条件下，细胞QBC939的体外迁徙能力最弱。本实验从一定角度说明受体蛋白CXCR3和趋化因子ITAC之间的互做对细胞的迁徙能力增强有促进作用。　　 （三）小结　　 通过本实验研究，我们应用免疫组织化学方法测定I-TAC—CXCR3在结肠癌及肝转移组织呈高表达，应用PAS/CD31双重染色测定肝转移组结肠癌组织中血管生成拟态成高表达，同时培养结肠癌肝转移细胞株，从体外细胞模型证实了I-TAC-CXCR3对结肠癌细胞增殖、定向迁移及侵袭能力有促进作用。所得数据通过统计学处理，分析结果，由此我们认为I-TAC—CXCR3通过血管生成拟态诱导结肠癌肝转移是其机制之一。那么，应用I-TAC—CXCR3及血管生成拟态对肿瘤进行检测，就建立了结肠癌肝转移的预测机制，沉默CXCR3为在结肠癌可能转移的早期进行干预、进一步降低转移率提供理论支持。