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第一部分 P物质基因敲除对小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎病理进程的影响
目的：研究表明神经肽P物质（substance P，SP）在病毒性角膜炎初发感染阶段表达升高，并且在上调早期炎症因子和促进细胞病变方面发挥免疫调理作用，但SP基因敲除后对小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎的病程及机制的影响尚不明确。本实验拟通过观察 SP 基因敲除后小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型病程进展，对角膜中病毒载量进行检测，探索其发病过程特征性变化，并探讨通过给予C57BL/6小鼠腹腔注射SP受体抑制剂后再接种HSV-1能否模拟SP基因敲除小鼠HSK模型的病程特点。
方法：
1. 鼠尾鉴定法鉴定SP基因敲除小鼠，对正常P物质基因敲除小鼠与C57BL/6小鼠裂隙灯照相、角膜HE染色、角膜神经染色、角膜敏感度及基础泪液分泌等指标进行比较。
2. ELISA检测不同时间点HSV-1 感染C57BL/6小鼠后角膜组织中SP表达变化。
3. 构建SP基因敲除小鼠与C57BL/6小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型，观察感染后第3、7、11、、28及复发后第2天两组小鼠角膜混浊程度、新生血管及角膜敏感度的变化，并进行评分。免疫荧光检测不同时间点角膜组织中HSV-1 的表达情况。空斑试验检测感染后第3、7天角膜组织中的病毒滴度。进一步利用绝对定量PCR检测不同时间点角膜及三叉神经节中病毒相关指标ICP0、ICP27、TK、VP16、UL41及LAT的变化。
4. 利用腹腔注射SP受体抑制剂L-733060模拟SP基因敲除小鼠。将C57BL/6小鼠随机分为腹腔注射SP组、L-733060组及空白对照组，均给予角膜接种HSV-1后，观察不同组别间症状变化，并对角膜病变、病毒滴度及病毒感染相关指标进行检测，以验证腹腔注射L-733060 能否模拟SP基因敲除小鼠HSK病程。
结果：
1. SP基因敲除小鼠与正常C57BL/6小鼠从角膜形态、角膜神经丛分布、角膜敏感度及基础泪液分泌量等方面进行比较，两组之间无明显差异（P>0.05）。
2. 在C57BL/6小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型中，角膜中SP含量在初发感染阶段第3天表达增加，随着角膜症状消退，SP含量逐渐下降，病程进入潜伏期。在复发感染阶段第2天SP表达随着病程发展呈现再次增加。
3. 比较HSV-1感染C57BL/6小鼠与SP基因敲除小鼠后不同时间点角膜病变形态、角膜浑浊度、新生血管及敏感度变化均无明显差异（P>0.05）。免疫荧光检测不同时间点角膜组织HSV-1分布发现，两组小鼠HSV-1表达主要位于上皮层，但感染后第 3 天及复发后第 2 天，SP 基因敲除小鼠 HSV-1 在上皮中表达较C57BL/6小鼠组更为明显，感染后第7天两组角膜HSV-1染色均不明显。空斑试验进行滴度检测与此结果一致。进一步通过绝对定量PCR检测发现感染后第3天角膜组织中病毒相关指标如ICP27、TK、UL41等SP基因敲除小鼠较C57BL/6 小鼠明显升高（P<0.001），三叉神经节组织中除 TK 以外，ICP0、ICP27、VP16、UL41等指标在SP基因敲除小鼠组中表达明显升高（P<0.05）。
4. 观察腹腔注射SP、L-733060及空白对照三组小鼠HSK病变形态，结果发现不同时间点各组间大体照相、角膜浑浊度、新生血管及敏感度无明显差异（P>0.05）。免疫荧光检测感染后第3天腹腔注射L-733060组角膜组织HSV-1较其他两组明显增加。空斑试验检测病毒滴度发现感染后第3天L-733060组较其他两组明显增加。绝对定量 PCR 检测结果提示感染后第 3 天角膜组织中 ICP0、ICP27、TK、VP16、UL41等指标表达L-733060组小鼠均明显较其他两组小鼠高（P<0.05），在三叉神经节中检测以上指标与角膜中具备一致性，感染后第 3 天L-733060组小鼠均较其他两组小鼠明显表达升高（P<0.05）。
结论：SP基因敲除后对小鼠角膜形态、神经支配、角膜敏感度及泪液基础分泌量无明显影响。首次发现 SP 的缺失可增加小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型角膜及三叉神经节中的病毒表达。腹腔注射SP受体抑制剂L-733060构建HSK模型与SP基因敲除小鼠HSK模型有较好的拟合度，可应用腹腔注射L-733060进行下一步的实验。
第二部分 SP基因敲除影响小鼠HSK模型病毒复制及炎性浸润的机制
目的：前期实验结果发现 SP 基因敲除后小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型感染初期角膜组织中病毒量增加，但症状与野生型无明显差异。通过进一步研究与HSV-1复制相关因子表达及炎性细胞浸润情况，探讨神经肽 SP 的缺失对小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎的影响及其相关机制。
方法：
1. 免疫荧光检测C57BL/6及SP基因敲除小鼠HSV-1感染后第3、7天及复发后第2天角膜组织中中性粒细胞、巨噬细胞、CD4及CD8 标记的免疫细胞的分布情况。将C57BL/6 小鼠随机分为腹腔注射SP组，L-733060组和空白对照组并构建小鼠HSK模型，应用免疫荧光检测各组HSV-1感染后第3天角膜组织中性粒细胞及巨噬细胞浸润情况。
2. RT-PCR检测C57BL/6及SP基因敲除小鼠感染后第3天角膜组织中与中性粒细胞相关趋化因子CXCL2、CCL3、MCP-1及IL-17B mRNA表达情况。
3. 免疫荧光及RT-PCR检测C57BL/6及SP基因敲除小鼠角膜组织中造模后第3天病毒侵袭相关受体heparanase的表达情况，利用RT-PCR检测C57BL/6与SP基因敲除小鼠角膜组织中与病毒侵袭其他受体HVEM、nectin-1及NEAT1，病毒限制性因子tetherin以及I型干扰素的表达情况。
4. RT-PCR检测腹腔注射空白对照、SP及L-733060三组感染后第3天角膜组织中病毒侵袭相关因子及I型干扰素mRNA水平表达量。
结果：
1. 免疫荧光结果提示SP基因敲除小鼠与C57BL/6小鼠感染第3和7天中角膜中 F4/80 标记的巨噬细胞主要定位于角膜上皮及基质层，由 Ly6G 标记的中性粒细胞主要定位于C57BL/6小鼠的上皮及基质层，SP基因敲除小鼠角膜Ly6G阳性标记中性粒细胞较野生型小鼠明显减少。在复发的第2天两组小鼠角膜中均存在大量的巨噬细胞和中性粒细胞浸润。此外，结果提示感染后第3天CD4细胞定位于角膜上皮及基质层，两组小鼠之间未见明显差异，CD8a 标记细胞主要在C57BL/6 小鼠角膜中的上皮及基质层表达，但在敲除小鼠角膜中未见明显表达。
2. RT-PCR结果提示HSV-1感染后第3天，与C57BL/6小鼠相比，角膜组织中性粒细胞相关趋化因子CXCL2、CCL3及IL-17B在 SP基因敲除小鼠表达有所降低（P<0.05），MCP-1因子在SP基因敲除小鼠中表达升高（P<0.01）。
3. 感染后第3天RT-PCR检测小鼠角膜组织发现SP基因敲除小鼠与C57BL/6小鼠heparanase免疫荧光及mRNA水平表达未见明显差异（P>0.05），但其他细胞表面病毒相关侵袭受体 nectin-1 及 NEAT1 在 SP 基因敲除小鼠的角膜组织中mRNA水平表达升高（P<0.001），病毒限制性因子tetherin在SP基因敲除小鼠角膜中表达降低（P<0.001）。腹腔注射模型三组感染后第3天角膜组织中HVEM及nectin-1受体mRNA 表达水平L-733060组较其他两组均升高（P<0.05），L-733060组中tetherin表达水平较其他两组降低（P<0.001）。
4. SP基因敲除小鼠感染后第3天抗病毒因子I型干扰素IFN-α及IFN-βmRNA表达水平均较C57BL/6小鼠低（P<0.05），感染后第28天SP基因敲除小鼠HSK模型角膜组织中IFN-γmRNA表达水平较对照组明显增加（P<0.01）。在腹腔注射L-733060 组中 I 型干扰素 IFN-α 及 IFN-βmRNA 表达水平均较其他两组低（P<0.05），与基因敲除小鼠表达趋势一致。
结论：SP缺失后减少HSK第3天角膜组织中性粒细胞的趋化，而角膜中病毒滴度增加可能与识别病毒的细胞表面受体增加、抗病毒相关因子IFN-α及IFN-β的表达降低以及浸润进入角膜的免疫细胞减少有关。以上表明 SP 参与调控 HSV-1侵袭及复制相关基因表达，从而对病毒起到一定控制作用。
第三部分 P物质通过调控STING/TBK1/IRF3信号通路影响HSV-1在人角膜上皮细胞中的感染
目的：角膜上皮细胞是宿主抵御病毒侵袭的第一道防线，但 SP 如何具体在上皮细胞中调控 HSV-1 感染目前尚无报道。通过建立 HSV-1 感染人角膜上皮细胞系（HCEC）体外模型，观察给予SP及不同浓度L-733060处理后对病毒复制影响，并进一步探讨SP缺失后如何调控与病毒感染相关机制。
方法：通过体外培养人角膜上皮细胞系，利用CCK-8法检测给予细胞SP及不同浓度梯度L-733060处理后对细胞活力的影响，确定药物干预浓度。将细胞分组为空白对照组、单纯 HSV-1 感染组、HSV-1+SP 10μmol/L 组、HSV-1+L-733060 0.1μmol/L 组、HSV-1+L-733060 1μmol/L 组及HSV-1+L-733060 10μmol/L 组，药物预处理12小时并进行HSV-1感染24小时后观察细胞形态变化，提取细胞蛋白利用Western Blot检测STING/TBK1/IRF3信号通路相关蛋白及相应磷酸化蛋白。结果：
1. 利用 CCK-8 法检测给予人角膜上皮细胞不同种类及浓度药物处理后细胞活力的变化，结果分析发现人角膜上皮细胞加入L-733060 20μmol/L干预12小时后细胞活力明显比其他组别明显下降（P<0.05），其他各组之间细胞活力无明显差异（P>0.05）。
2. 观察SP及不同浓度梯度L-733060对HCEC感染HSV-1后细胞病变影响，空白对照组HCEC可长满培养板底部，加入HSV-1感染的细胞组中均可见不同程度的细胞病变。在培养液中加入L-733060 10μmol/L组感染HSV-1后细胞病变效应与其他组相比更明显。
3. Western-blot检测HCEC细胞给予SP及不同浓度梯度的L-733060药物干预后 STING/TBK1/IRF3 信号通路蛋白及其磷酸化蛋白表达变化。结果显示， P-IRF3及P-TBK1的表达量随着L-733060干预浓度的增加逐渐下降，以L-733060 10μmol/L 处理组下降程度最为明显（P<0.05）。STING 蛋白表达量组间无明显差异（P>0.05）。与单纯感染HSV-1组相比，tetherin蛋白的表达在L-733060 10μmol/L组中明显下降（P<0.001）。
结论：外源性L-733060通过 STING/TBK1/IRF3信号通路调控人角膜上皮细胞中HSV-1的感染过程，L-733060增加病毒感染的作用机制可能是通过下调TBK1及IRF3的表达，干预抗病毒信号通路的转导。
目的：研究表明神经肽P物质（substance P，SP）在病毒性角膜炎初发感染阶段表达升高，并且在上调早期炎症因子和促进细胞病变方面发挥免疫调理作用，但SP基因敲除后对小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎的病程及机制的影响尚不明确。本实验拟通过观察 SP 基因敲除后小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型病程进展，对角膜中病毒载量进行检测，探索其发病过程特征性变化，并探讨通过给予C57BL/6小鼠腹腔注射SP受体抑制剂后再接种HSV-1能否模拟SP基因敲除小鼠HSK模型的病程特点。
方法：
1. 鼠尾鉴定法鉴定SP基因敲除小鼠，对正常P物质基因敲除小鼠与C57BL/6小鼠裂隙灯照相、角膜HE染色、角膜神经染色、角膜敏感度及基础泪液分泌等指标进行比较。
2. ELISA检测不同时间点HSV-1 感染C57BL/6小鼠后角膜组织中SP表达变化。
3. 构建SP基因敲除小鼠与C57BL/6小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型，观察感染后第3、7、11、、28及复发后第2天两组小鼠角膜混浊程度、新生血管及角膜敏感度的变化，并进行评分。免疫荧光检测不同时间点角膜组织中HSV-1 的表达情况。空斑试验检测感染后第3、7天角膜组织中的病毒滴度。进一步利用绝对定量PCR检测不同时间点角膜及三叉神经节中病毒相关指标ICP0、ICP27、TK、VP16、UL41及LAT的变化。
4. 利用腹腔注射SP受体抑制剂L-733060模拟SP基因敲除小鼠。将C57BL/6小鼠随机分为腹腔注射SP组、L-733060组及空白对照组，均给予角膜接种HSV-1后，观察不同组别间症状变化，并对角膜病变、病毒滴度及病毒感染相关指标进行检测，以验证腹腔注射L-733060 能否模拟SP基因敲除小鼠HSK病程。
结果：
1. SP基因敲除小鼠与正常C57BL/6小鼠从角膜形态、角膜神经丛分布、角膜敏感度及基础泪液分泌量等方面进行比较，两组之间无明显差异（P>0.05）。
2. 在C57BL/6小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型中，角膜中SP含量在初发感染阶段第3天表达增加，随着角膜症状消退，SP含量逐渐下降，病程进入潜伏期。在复发感染阶段第2天SP表达随着病程发展呈现再次增加。
3. 比较HSV-1感染C57BL/6小鼠与SP基因敲除小鼠后不同时间点角膜病变形态、角膜浑浊度、新生血管及敏感度变化均无明显差异（P>0.05）。免疫荧光检测不同时间点角膜组织HSV-1分布发现，两组小鼠HSV-1表达主要位于上皮层，但感染后第 3 天及复发后第 2 天，SP 基因敲除小鼠 HSV-1 在上皮中表达较C57BL/6小鼠组更为明显，感染后第7天两组角膜HSV-1染色均不明显。空斑试验进行滴度检测与此结果一致。进一步通过绝对定量PCR检测发现感染后第3天角膜组织中病毒相关指标如ICP27、TK、UL41等SP基因敲除小鼠较C57BL/6 小鼠明显升高（P<0.001），三叉神经节组织中除 TK 以外，ICP0、ICP27、VP16、UL41等指标在SP基因敲除小鼠组中表达明显升高（P<0.05）。
4. 观察腹腔注射SP、L-733060及空白对照三组小鼠HSK病变形态，结果发现不同时间点各组间大体照相、角膜浑浊度、新生血管及敏感度无明显差异（P>0.05）。免疫荧光检测感染后第3天腹腔注射L-733060组角膜组织HSV-1较其他两组明显增加。空斑试验检测病毒滴度发现感染后第3天L-733060组较其他两组明显增加。绝对定量 PCR 检测结果提示感染后第 3 天角膜组织中 ICP0、ICP27、TK、VP16、UL41等指标表达L-733060组小鼠均明显较其他两组小鼠高（P<0.05），在三叉神经节中检测以上指标与角膜中具备一致性，感染后第 3 天L-733060组小鼠均较其他两组小鼠明显表达升高（P<0.05）。
结论：SP基因敲除后对小鼠角膜形态、神经支配、角膜敏感度及泪液基础分泌量无明显影响。首次发现 SP 的缺失可增加小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型角膜及三叉神经节中的病毒表达。腹腔注射SP受体抑制剂L-733060构建HSK模型与SP基因敲除小鼠HSK模型有较好的拟合度，可应用腹腔注射L-733060进行下一步的实验。
第二部分 SP基因敲除影响小鼠HSK模型病毒复制及炎性浸润的机制
目的：前期实验结果发现 SP 基因敲除后小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型感染初期角膜组织中病毒量增加，但症状与野生型无明显差异。通过进一步研究与HSV-1复制相关因子表达及炎性细胞浸润情况，探讨神经肽 SP 的缺失对小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎的影响及其相关机制。
方法：
1. 免疫荧光检测C57BL/6及SP基因敲除小鼠HSV-1感染后第3、7天及复发后第2天角膜组织中中性粒细胞、巨噬细胞、CD4及CD8 标记的免疫细胞的分布情况。将C57BL/6 小鼠随机分为腹腔注射SP组，L-733060组和空白对照组并构建小鼠HSK模型，应用免疫荧光检测各组HSV-1感染后第3天角膜组织中性粒细胞及巨噬细胞浸润情况。
2. RT-PCR检测C57BL/6及SP基因敲除小鼠感染后第3天角膜组织中与中性粒细胞相关趋化因子CXCL2、CCL3、MCP-1及IL-17B mRNA表达情况。
3. 免疫荧光及RT-PCR检测C57BL/6及SP基因敲除小鼠角膜组织中造模后第3天病毒侵袭相关受体heparanase的表达情况，利用RT-PCR检测C57BL/6与SP基因敲除小鼠角膜组织中与病毒侵袭其他受体HVEM、nectin-1及NEAT1，病毒限制性因子tetherin以及I型干扰素的表达情况。
4. RT-PCR检测腹腔注射空白对照、SP及L-733060三组感染后第3天角膜组织中病毒侵袭相关因子及I型干扰素mRNA水平表达量。
结果：
1. 免疫荧光结果提示SP基因敲除小鼠与C57BL/6小鼠感染第3和7天中角膜中 F4/80 标记的巨噬细胞主要定位于角膜上皮及基质层，由 Ly6G 标记的中性粒细胞主要定位于C57BL/6小鼠的上皮及基质层，SP基因敲除小鼠角膜Ly6G阳性标记中性粒细胞较野生型小鼠明显减少。在复发的第2天两组小鼠角膜中均存在大量的巨噬细胞和中性粒细胞浸润。此外，结果提示感染后第3天CD4细胞定位于角膜上皮及基质层，两组小鼠之间未见明显差异，CD8a 标记细胞主要在C57BL/6 小鼠角膜中的上皮及基质层表达，但在敲除小鼠角膜中未见明显表达。
2. RT-PCR结果提示HSV-1感染后第3天，与C57BL/6小鼠相比，角膜组织中性粒细胞相关趋化因子CXCL2、CCL3及IL-17B在 SP基因敲除小鼠表达有所降低（P<0.05），MCP-1因子在SP基因敲除小鼠中表达升高（P<0.01）。
3. 感染后第3天RT-PCR检测小鼠角膜组织发现SP基因敲除小鼠与C57BL/6小鼠heparanase免疫荧光及mRNA水平表达未见明显差异（P>0.05），但其他细胞表面病毒相关侵袭受体 nectin-1 及 NEAT1 在 SP 基因敲除小鼠的角膜组织中mRNA水平表达升高（P<0.001），病毒限制性因子tetherin在SP基因敲除小鼠角膜中表达降低（P<0.001）。腹腔注射模型三组感染后第3天角膜组织中HVEM及nectin-1受体mRNA 表达水平L-733060组较其他两组均升高（P<0.05），L-733060组中tetherin表达水平较其他两组降低（P<0.001）。
4. SP基因敲除小鼠感染后第3天抗病毒因子I型干扰素IFN-α及IFN-βmRNA表达水平均较C57BL/6小鼠低（P<0.05），感染后第28天SP基因敲除小鼠HSK模型角膜组织中IFN-γmRNA表达水平较对照组明显增加（P<0.01）。在腹腔注射L-733060 组中 I 型干扰素 IFN-α 及 IFN-βmRNA 表达水平均较其他两组低（P<0.05），与基因敲除小鼠表达趋势一致。
结论：SP缺失后减少HSK第3天角膜组织中性粒细胞的趋化，而角膜中病毒滴度增加可能与识别病毒的细胞表面受体增加、抗病毒相关因子IFN-α及IFN-β的表达降低以及浸润进入角膜的免疫细胞减少有关。以上表明 SP 参与调控 HSV-1侵袭及复制相关基因表达，从而对病毒起到一定控制作用。
第三部分 P物质通过调控STING/TBK1/IRF3信号通路影响HSV-1在人角膜上皮细胞中的感染
目的：角膜上皮细胞是宿主抵御病毒侵袭的第一道防线，但 SP 如何具体在上皮细胞中调控 HSV-1 感染目前尚无报道。通过建立 HSV-1 感染人角膜上皮细胞系（HCEC）体外模型，观察给予SP及不同浓度L-733060处理后对病毒复制影响，并进一步探讨SP缺失后如何调控与病毒感染相关机制。
方法：通过体外培养人角膜上皮细胞系，利用CCK-8法检测给予细胞SP及不同浓度梯度L-733060处理后对细胞活力的影响，确定药物干预浓度。将细胞分组为空白对照组、单纯 HSV-1 感染组、HSV-1+SP 10μmol/L 组、HSV-1+L-733060 0.1μmol/L 组、HSV-1+L-733060 1μmol/L 组及HSV-1+L-733060 10μmol/L 组，药物预处理12小时并进行HSV-1感染24小时后观察细胞形态变化，提取细胞蛋白利用Western Blot检测STING/TBK1/IRF3信号通路相关蛋白及相应磷酸化蛋白。结果：
1. 利用 CCK-8 法检测给予人角膜上皮细胞不同种类及浓度药物处理后细胞活力的变化，结果分析发现人角膜上皮细胞加入L-733060 20μmol/L干预12小时后细胞活力明显比其他组别明显下降（P<0.05），其他各组之间细胞活力无明显差异（P>0.05）。
2. 观察SP及不同浓度梯度L-733060对HCEC感染HSV-1后细胞病变影响，空白对照组HCEC可长满培养板底部，加入HSV-1感染的细胞组中均可见不同程度的细胞病变。在培养液中加入L-733060 10μmol/L组感染HSV-1后细胞病变效应与其他组相比更明显。
3. Western-blot检测HCEC细胞给予SP及不同浓度梯度的L-733060药物干预后 STING/TBK1/IRF3 信号通路蛋白及其磷酸化蛋白表达变化。结果显示， P-IRF3及P-TBK1的表达量随着L-733060干预浓度的增加逐渐下降，以L-733060 10μmol/L 处理组下降程度最为明显（P<0.05）。STING 蛋白表达量组间无明显差异（P>0.05）。与单纯感染HSV-1组相比，tetherin蛋白的表达在L-733060 10μmol/L组中明显下降（P<0.001）。
结论：外源性L-733060通过 STING/TBK1/IRF3信号通路调控人角膜上皮细胞中HSV-1的感染过程，L-733060增加病毒感染的作用机制可能是通过下调TBK1及IRF3的表达，干预抗病毒信号通路的转导。