论文部分内容阅读
猪表皮生长因子(porcine Epidermal Growth Factor，pEGF)是一种含有53个氨基酸的单链多肽类生长因子，具有刺激细胞分裂、增殖与分化，促进离子交换和细胞外基质合成等生物学特性。已有文献报道pEGF对提高母猪繁殖率，对抗断奶应激，促进断奶仔猪胃肠道发育具有显著作用。本研究通过建立测定pEGF生物学活性的方法、摸索pEGF基因工程菌的高密度发酵工艺、建立发酵上清中pEGF纯化方法、制备pEGF多克隆抗体以及研究高密度发酵pEGF对断奶仔猪促生长作用，为pEGF的应用开发打下基础。
为了了解pEGF酵母基因工程菌表达的pEGF是否具有生物学活性，用pEGF酵母工程菌摇瓶获得的pEGF(1-1000ng/mL)与BALB/c小鼠3T3细胞一起孵育，发现1-1000ng/mL的摇瓶获得的pEGF具有显著的促进细胞增殖的活性。
用5L和10L发酵罐系统，利用无机盐溶液作为生长培养基，按不同的发酵方案(包括不同的溶氧度、甘油补加方式、甲醇流加方式)进行高密度发酵，结果基因工程菌10L发酵罐系统的最佳发酵工艺为：整个发酵过程中控制T=30℃，pH5.0，DO>20％；甘油流加速度为24mL/h/L，流加4h，饥饿培养20min，梯度流加甲醇(3mL/h/L流加2h，6mL/h/L流加2h，9mL/h/L流加2h，15mL/h/L流加48h)，然后停止流加甲醇，直到DO上升到100％，放罐下机。从诱导开始到放罐，每隔24h加入灭菌的酸水解酪蛋白防止表达的pEGF降解。
高密度发酵上清中pEGF的纯化：高密度发酵液调pH至7.8，然后离心去细胞，发酵上清先后经0.8μm的滤膜过滤、0.45μm滤膜超滤、30kd的滤膜超滤后，超滤后的透滤液用Ni-NTA亲和层析柱纯化，纯化的产物进行SDS-PAGE分析其纯度，用 western blot以及生物活性检测方法鉴定其与抗体亲和力以及生物活性。结果，以上纯化方法纯化的pEGF在SDS-PAGE图中没有观察到任何杂蛋白质条带，western blot中观察到了免疫印迹条带，生物活性检测证明其在100ng/mL的浓度具有显著的促进细胞增殖作用，表明其有生物学活性，但是活性有所降低。
为了得到pEGF多克隆抗体，直接用pEGF的PBS溶液和弗氏完全佐剂免疫家兔，pEGF的PBS溶液和弗氏不完全佐剂乳化加强免疫。结果获得的抗体血清效价为1：12，800。
27-34d断奶的仔猪分成4组，每组16头或18头。高密度发酵的pEGF 1.5mg/kg的浓度添加到断奶仔猪的基础饲料或全价饲料，饲喂27-34d断奶仔猪14d，同时设基础饲料或全价饲料的对照组。结果在基础饲料或全价饲料添加1.5mg/kg pEGF，无论是在0-7d还是0-14d的增重以及平均日增重与对照组相比均无显著性差异。在14d内，B组(基础饲料中添加1.5mg/kg pEGF)仔猪的腹泻率显著低于A组(基础饲料对照组)(p<0.05)：D组(全价饲料中添加1.5mg/kg pEGF)仔猪的腹泻率极显著低于C组(全价饲料对照组)(p<0.01)。本研究建立了pEGF基因工程菌表达高密度发酵的方案、高密度发酵产物中pEGF的纯化方法以及检测重组pEGF生物学活性方法，发现本研究室构建的基因工程菌表达的pEGF能刺激家兔生产抗体、具有促进细胞增殖的活性以及降低断奶仔猪的腹泻。