肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，肺癌侵袭、转移而出现复发并产生耐药性，是治疗的主要难点，因此深入研究促进肺癌侵袭、转移的相关分子和通路，对指导和完善临床治疗具有重要的意义。　　 Wnt信号通路的异常激活与肿瘤增殖及侵袭转移的关系非常密切，主要由Wnt分子、Dishevelled(DVL/DSH)、Axin、GSK3β、β-catenin和TCF-4组成。该通路中的关键分子（如Axin及β-catenin等）在肺癌的侵袭转移及预后方面已有较多的报道。然而，影响该通路中各组成分子的因素很复杂，尚不十分清楚。最近有文章报道Zbed3（Zinc-finger BED Domain-containing3）----一种锌指结构蛋白，能与Wnt信号通路中的负性调控因子Axin结合，通过抑制Axin-GSK3β复合体的功能，导致β-catenin的降解受阻，上调Wnt/β-catenin的通路激活，从而促进细胞增殖。该研究明确了Zbed3分子结构中第107-113位氨基酸的“PPPPSPT”序列为其与Axin结合的关键位点。Zbed3含有1个锌指结构域，共有234个氨基酸。目前，关于Zbed3的相关论文只有上述这一篇报道（以其为关键词在pubmed上搜索），且是在NIH3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）中完成的，目前还没有关于Zbed3在人类肿瘤中的表达及作用的报道。本研究旨在揭示Zbed3在非小细胞肺癌中的表达、对肺癌生物学行为的影响、临床意义及可能存在的对β-catenin等分子的调节作用。　　 我们还研究了一新近发现的BTB(POZ)结构域蛋白Btbd7(BTB(POZ)domain containing7)在非小细胞肺癌中的表达。相对于正常上皮细胞，肺癌中上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）表达减少甚至缺失，与肿瘤的进展密切相关，但在肺癌中E-cadherin下调的机制还不完全清楚。有研究发现Btbd7在涎腺及肺发育过程中起到重要作用。当胚基(bud)形成裂(cleft)的时候，细胞之间的黏附转变为细胞与基质之间的黏附，使得发育中的组织得以形成分支，而Btbd7在新生的裂中表达升高，同时伴有E-cadherin的下调。进一步在MDCK(Madin-Darbycanine kidney)细胞中的研究也证实Btbd7能下调E-cadherin并促进细胞的扩散。然而，关于Btbd7如何下调E-cadherin的机制还不清楚。　　 这些研究资料使我们想到，在分化异常的肺癌组织中是否可能存在Btbd7的表达，如果有表达对肺癌的侵袭、转移又有着怎样的影响？关于Btbd7的研究很少，目前还没有其在恶性肿瘤中蛋白表达作用的相关研究。本研究旨在揭示Btbd7在非小细胞肺癌中的表达、临床意义及可能存在的下调E-cadherin表达及促进肺癌细胞恶性表型的机制。　　 Paxillin（桩蛋白）是又一重要的细胞粘附分子，在细胞粘附，细胞运动及信号转导等方面都发挥着重要的作用。我们发现Brk(Breast tumor kinase)在非小细胞肺癌中高表达，这一蛋白首先被报导在乳腺癌中高表达并与肿瘤进展相关。已有报导该蛋白可能通过调节Paxillin促进细胞迁移。我们在本研究中检测了Brk在非小细胞肺癌中的表达并分析与临床病理因素之间的关系，包括与E-cadherin，P53及Ki67之间的关联，初步探讨其可能具有的促进肿瘤进展的临床病理学意义。　　 材料与方法　　 1、石蜡组织标本　　 原发性肺癌组织及癌旁正常肺组织均来自中国医科大学附属第一临床学院原发性肺癌患者外科手术切除标本（2003-2009年），患者术前均未接受放、化疗。部分病例有完整的生存随访资料。　　 2、新鲜组织标本　　 部分病例保存新鲜肺癌及癌旁肺组织，经快速冷冻，于-70℃保存用于WesternBlot检测。　　 3、细胞系　　 A549，LTE，SPC，NCI-H1299，NCI-H460，LK等肺癌细胞系及支气管上皮细胞系HBE用于体外细胞学研究。　　 4、免疫组化　　 按链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P)法试剂盒说明书步骤进行。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定:同时观察染色强度(Ⅰ)及范围(S)。染色强度分为强、中等及弱三个级别。棕黄色颗粒粗大、色深记为强表达，棕黄色颗粒细密，染色浅记为弱表达，中度表达介于二者之间。染色范围大于等于10％记为阳性，并分为0-4四个等级，其中小于10％记为0分，同时代表阴性，10％≤S＜25％记为1分，25％≤S＜50％记为2分，50％≤S＜75％记为3分，75％≤S记为4分。最后计算染色强度及范围的乘积作为表达水平，进行统计学分析。　　 5、免疫荧光染色　　 将接种在24孔板中的细胞用PBS冲洗，用4％的多聚甲醛于冰上固定20分钟。洗过后用0.2％的Triton X-100于常温打孔15-30分钟，之后用PBS冲洗。打孔后用1％的BSA常温封闭30分钟。封闭完后弃去封闭液加入一抗于4℃孵育过夜。PBS冲洗后在暗室中加入二抗(异硫氰酸荧光素(FITC)或罗丹明(TRITC)标记的IgG）。PBS冲洗后，加入DAPI染液进行核复染。PBS冲洗后，用荧光显微镜观察。　　 6、Western Blot　　 获得新鲜组织块或收集的细胞，按体积比1∶5加入蛋白裂解液，用超声仪粉碎细胞（组织块需用匀浆机匀浆），离心后收集上清。测定蛋白浓度后将含40-80ug总蛋白的裂解产物进行10％ SDS-PAGE电泳，后转印至硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶粉封闭2h，之后用一抗孵育过夜。蛋白含量通过增强化学发光法检测并取其与β-actin或GADPH的比值作为蛋白的相对表达量。　　 7、Transwell侵袭实验　　 于无菌条件下将胶体加入上室，确保均匀覆盖底部，于温箱静置2小时。取100ul细胞悬液(5x106个/ml)滴入上室内，下室加入培养液，将小室置37℃，5％ CO2条件下放置，24小时后弃去上室内液体，擦尽胶，100％甲醇固定15分钟，常规苏木素染色，光镜下计数细胞数。每个实验重复三次。　　 8、划痕实验　　 在6孔板中加入细胞悬液，贴壁形成单层细胞后，用消毒100ul枪头均匀划2条竖直线，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞。放入培养箱培养(5％ CO2，37℃)。在不同时间点显微镜下观察，测量划痕宽度变化。每个实验重复三次。　　 9、琼脂克隆形成实验　　 将贴壁细胞用胰酶消化悬浮后计数，将悬浮细胞按1000个细胞/皿种植于直径6cm的小皿中，放入培养箱(5％ CO2，37℃)培养10天，用甲醇固定后行苏木素染色，于显微镜下观察并计数细胞集落。每个实验重复三次。　　 10、统计学分析　　 采用SPSS for windows13.0统计分析软件进行分析。p＜0.05为有统计学意义。　　 结果：　　 1、Zbed3在非小细胞肺癌中的表达及意义　　 1.1 Zbed3在非小细胞肺癌及正常肺组织中的表达　　 免疫组化实验显示Zbed3表达定位于细胞浆及少数胞核，在非小细胞肺癌癌细胞中表达的阳性率为59.0％(62/105)，显著高于正常肺组织18.0％(9/50)(p＜0.05)。Zbed3在非小细胞肺癌中的表达与淋巴结转移及TNM分期相关，在有淋巴结转移组表达阳性率(74.4％，32/43)高于无淋巴结转移组(45.4％，30/62)(p＜0.01)，在高TNM分期组（Ⅲ+Ⅳ组）(71.7％，33/46)高于低分期组（Ⅰ+Ⅱ组）(49.2％，29/59)(p＜0.05)。生存分析显示Zbed3在非小细胞肺癌中的表达与患者不良预后相关，阳性病例患者生存时间(40.1m±4.7)显著低于Btbd7阴性病例(56.4m±5.0)(p＜0.05)。Westem Blot实验也证实Zbed3在非小细胞肺癌组织中的表达显著高于癌旁正常肺组织(p＜0.05）。　　 1.2 Zbed3调节肺癌细胞增殖及侵袭能力　　 Western Blot检测显示在A549、NCI-H157、NCI-H460、LK、LTE、SPC、NCI-H1299等非小细胞肺癌细胞系中均存在Zbed3的过表达（相对于正常支气管上皮细胞系HBE）(p＜0.05)。选取Axin和GSK-3β均有表达并高表达Zbed3的NCI-H1299细胞进行下一步实验。免疫荧光实验显示Zbed3及Axin在NCI-H1299细胞中存在胞浆内的共定位。利用Zbed3 siRNA转染细胞特异性的干扰Zbed3表达，利用克隆形成实验检测癌细胞增殖能力，发现Zbed3蛋白表达下调后癌细胞增殖能力相对于未干扰组显著减弱(p＜0.05);利用Transwell方法检测癌细胞侵袭能力发现，下调Zbed3蛋白表达后癌细胞侵袭能力相比未干扰组显著下降(p＜0.05)。　　 1.3 Zbed3调节β-catenin及下游靶基因的表达　　 用Zbed3 siRNA转染NCI-H1299细胞干扰Zbed3表达，发现下调Zbed3蛋白表达后，癌细胞中β-catenin及下游靶基因c-myc和cyclin D1表达水平相对于未干扰组显著下降(p＜0.05）。　　 2、Btbd7在非小细胞肺癌中的表达及意义　　 2.1 Btbd7在非小细胞肺癌及正常肺组织中的表达　　 免疫组化实验显示Btbd7表达定位于细胞浆，在非小细胞肺癌中表达的阳性率为51.8％(57/110)，显著高于正常肺组织11.3％(6/53)(p＜0.001)。Btbd7在非小细胞肺癌中的表达与组织学类型及淋巴结转移相关，在腺癌组织中的表达(61.7％，37/60)高于鳞癌(40.0％20/50)(p＜0.05)，在有淋巴结转移的病例(62.5％，30/48)高于无转移病例(43.5％，27/62)(p＜0.05)。Btbd7在非小细胞肺癌中的表达与E-cadherin及N-cadherin的异常表达显著相关(p＜0.05）（相关系数分别为0.274及0.257）。生存分析显示Btbd7在非小细胞肺癌中的表达与患者不良预后相关，阳性病例患者生存时间(43.2m±4.5)显著低于Btbd7阴性病例(54.5m±5.2)(p＜0.05)。Western Blot实验也证实Btbd7在非小细胞肺癌组织中的表达显著高于癌旁正常肺组织(p＜0.05)。　　 2.2 Btbd7调节肺癌细胞迁移能力　　 Western Blot实验显示Btbd7在HBE，A549，LK，LTE，NCI-H157，NCI-H1299，NCI-H460及SPC等细胞系中存在表达， NCI-H1299，LTE等肺癌细胞系中的表达高于正常支气管上皮HBE细胞系(p＜0.05）。用Btbd7 siRNA转染肺癌细胞NCI-H1299干扰Btbd7表达后，利用划痕实验方法检测癌细胞迁移能力发现，下调Btbd7蛋白表达后癌细胞迁移能力相比未干扰组显著下降(p＜0.05)。　　 2.3 Btbd7表达调节肺癌细胞E-cadherin表达　　 用Btbd7 siRNA转染肺癌细胞NCI-H1299干扰Btbd7表达，发现下调Btbd7蛋白表达后，癌细胞E-cadherin表达水平相对于未干扰组显著升高(p＜0.05）。　　 结论：　　 1、Zbed3及Btbd7在非小细胞肺癌中过表达。　　 2、Zbed3在非小细胞肺癌中过表达与TNM分期及淋巴结转移相关并与患者不良预后相关。　　 3、Btbd7在非小细胞肺癌中过表达与组织学类型，淋巴结转移及患者不良预后相关。　　 4、下调Zbed3的表达能显著下调癌细胞的增殖及侵袭能力，可能与其下调β-catenin及其下游靶基因的表达有关　　 5、下调Btbd7表达能显著减弱肺癌细胞的迁移能力，可能与其调节E-cadherin的表达有关。