【摘 要】
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当归是我国著名的传统中药之一,现代研究已证实当归多糖和当归小分子具有重要的药理功效,但对于当归蛋白质的种类及生物学效应却知之甚少。本研究通过80%硫酸按沉淀、Sephade
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当归是我国著名的传统中药之一,现代研究已证实当归多糖和当归小分子具有重要的药理功效,但对于当归蛋白质的种类及生物学效应却知之甚少。本研究通过80%硫酸按沉淀、Sephadex G-50凝胶过滤层析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析,从当归鲜品中纯化出两个ASPR-F(来自当归鲜品的病程相关蛋白)并命名为:ASPR-F-1和ASPR-F-2,两种含量最高的蛋白分子量分别为16.66 kDa和16.46 kDa。二者均为糖蛋白,糖基含量分别为1.8%和3.4%,在溶液中主要以单体形式存在,但会部分形成二聚体。测得ASPR-F-1 的N端 15个氨基酸残基为GIQKTEVEAPSTVSA,属于病程相关(PR-10)家族蛋白。ASPR-F-2经质谱鉴定也属于PR-10家族蛋白。二者均具有核糖核酸酶(RNase)活性,ASPR-F-2的RNase 比活(128.85 U/mg)高于ASPR-F-1 68.67 U/mg),二者具有相同的最适反应温度(50℃),但前者的最适pH为5.0,后者的为6.0。二者均在50℃下表现出最大的稳定性。同样的,本研究从当归生药中纯化出分子量分别为17.33 kDa和17.18 kDa,糖基含量分别为2.6%和8.2%,RNase 比活分别为73.60 U/mg和146.76 U/mg的两种PR-10蛋白亚型(命名为ASPR-C-1和ASPR-C-2)。两种蛋白的最适pH相近,为5.6左右,但最适温度不同,ASPR-C-1的为50℃,ASPR-C-2的为60℃。二者虽然在60℃下都表现出最大的酶活力稳定性,但在更高的处理温度(80-100℃)下,ASPR-C-1迅速失活,最终仅余20%左右活力,ASPR-C-2则表现出良好的热稳定性,仍有80%左右活力。在此基础上,本研究进一步制备了当归鲜品、当归生药及当归饮片中的ASPR总蛋白,分别命名为ASPR-F、ASPR-C和ASPR-S,并探究了不同炮制阶段当归ASPR总蛋白的生物学效应。实验结果表明,三阶段当归ASPR总蛋白均能促人正常肝细胞L02细胞的增殖,预防CCl4诱导的小鼠急性肝损伤,其中以ASPR-S效果最佳。0.5 mg/mL的ASPR-S可使L02细胞增殖率达263.14%。1.25 mg/mL的ASPR-S可使肝脏组织的MDA水平显著下降44.27%(P<0.05),以及CAT及GST活力显著上升113%及54%(P<0.05),T-AOC活力显著回升87.63%(P<0.05),同时小鼠血浆ALT和AST活力分别极显著下降98%和77.53%(P<0.01),几乎逆转至正常活力水平。本研究不仅首次从当归鲜品及当归生药中分离纯化出PR-10蛋白,发现其具有优秀的保肝效应,并且首次发现炮制可增强ASPR蛋白的保肝效应,既填补了当归蛋白研究领域的空白,又为中药炮制加工的科学性和必要性提供最直接的理论和实践依据。
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