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乳腺癌是目前临床中最常见的恶性肿瘤之一,在妇女恶性肿瘤中,其发病率居首位。近年来随着分子生物学技术及免疫学技术的迅速发展,乳腺癌的基因治疗已逐渐成为继手术、放疗、化疗和内分泌等传统治疗方法之后发展起来的一种新的治疗手段。乳腺癌生物学特性复杂,恶性程度高,其发生发展是一个多因素、多步骤、复杂的渐进过程,而端粒酶（telomerase）的激活是其中重要的一环。在近90%人肿瘤细胞中端粒酶呈高表达,而在绝大多数正常体细胞中端粒酶不表达,所以端粒酶成为了公认的最重要的肿瘤标志物之一。人端粒酶的三种亚单位成分:人端粒酶RNA（human telomerase RNA,hTR）、端粒酶相关蛋白Ⅰ（telomeraseassociated protein,TPI）、人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）当中,hTERT是端粒酶活性的限速亚单位,它对端粒酶的活性调控起着决定性作用,因而hTERT也成为了靶向端粒酶抗癌策略的理想靶点。研究表明,利用靶向hTERT的反义寡脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）可抑制端粒酶活性及肿瘤细胞的生长、诱导细胞调亡。但是,未经修饰的裸ASODN在体内应用时极易被血液中的核酸酶降解,而无法发挥其作用。为此,国内外研究者们尝试利用各种病毒或非病毒基因载体来保护和携带寡核苷酸,以解决在体内其容易被降解而不能稳定存在的难题,增加进入细胞内的反义核酸的量,提高其稳定性,确保其生物学效应。聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）是近年来兴起的一种极具应用潜能的非病毒基因载体,它可以把ASODN缩合成纳米级的颗粒状物,极大地提高转染效率。但是,PEI/ASODN纳米粒在体内应用时,会迅速地被单核吞噬细胞系统清除而降低转染效率;此外PEI还具有一定的细胞毒性。脂质体（liposome）具有无毒、无免疫原性、且具有组织相似性和相溶性等优点,用脂质体来包裹PEI/DNA压缩体制成LPD（liposome-PEI/DNA）复合物,能更好地保护、屏蔽PEI/ASODN压缩体。NGR（N:天冬酰氨酸,G:氨基乙酸,R:精氨酸）多肽序列可以与肿瘤新生血管受体CD13特异性结合,具有很强的肿瘤靶向性。本研究中采用的CNGRCK2HK3HK11多肽中的半胱氨酸（C）含有巯基（-SH）,可以与LPD表面的马来酰亚胺基团发生反应,从而达到靶向修饰的目的,得到具有肿瘤靶向功能的LPD复合物（NGR/LPD）来保护、靶向运载ASODN。本研究以hTERT为靶点,设计合成针对此靶点mRNA的反义寡核苷酸,制备了NGR修饰的脂质体-聚阳离子-ASODN复合物（NGR/LPD）,另外制备脂质体-聚阳离子-ASODN复合物（LPD）、B-PEI/ASODN缩合体（PEI/ASODN）作为实验对照,经过尾缘静脉注射入荷瘤裸鼠体内,观察制剂在体内对MCF-7细胞的hTERT基因、蛋白表达的影响、肿瘤细胞凋亡情况和相关凋亡蛋白的表达变化及对肿瘤细胞生长的影响。方法:1.NGR/LPD、PEI/ASODN、LPD复合物的制备。2.NGR/LPD相关性质的考察。3.NGR/LPD复合物的体内活性研究。BALB/c裸鼠皮下注射人乳腺癌细胞系MCF-7细胞悬液,建立人乳腺癌动物模型。3.1体内药物分布实验,共分为4组,每组3只裸鼠。实验组Ⅰ经尾缘静脉给予ASODN-FAM复合物200μl实验组Ⅱ经尾缘静脉给予PEI/ASODN-FAM复合物200μl实验组Ⅲ经尾缘静脉给予FAM标记LPD复合物200μl实验组Ⅳ经尾缘静脉给予FAM标记NGR/LPD复合物200μl分别于给药后1、3、6小时后短颈处死裸鼠,立即取出肝、肾、肺、脾和瘤体组织,冰冻切片,激光共聚焦显微镜下观察各组织的药物分布情况。3.2抑瘤实验分组,共分为9组,每组5只裸鼠。空白对照组:经尾缘静脉给予生理盐水200μl反义核酸组:经尾缘静脉给予ASODN溶液200μl正义NGR/LPD组:经尾缘静脉给予SODN制备的正义NGR/LPD混悬液200μlPEI/ASODN高剂量组:经尾缘静脉给予PEI/ASODN混悬液200μlPEI/ASODN低剂量组:经尾缘静脉给予PEI/ASODN混悬液100μlLPD高剂量组:经尾缘静脉给予LPD混悬液200μlLPD低剂量组:经尾缘静脉给予LPD混悬液100μlNGR/LPD高剂量组:经尾缘静脉给予NGR/LPD混悬液200μlNGR/LPD低剂量组:经尾缘静脉给予NGR/LPD混悬液100μl各实验组裸鼠隔天给药一次,连续给药三周。每三天测定瘤体大小一次,测定三周。计算移植瘤的体积,绘制生长曲线。4.移植瘤组织、各脏器作常规病理切片,显微镜下观察病理形态学改变。5.免疫组化技术检测移植瘤hTERT蛋白以及凋亡相关蛋白Bcl-2,C-myc蛋白表达情况。6.采用半定量RT-PCR法检测瘤组织hTERT mRNA的表达情况。7.采用TUNEL法原位检测各组肿瘤细胞凋亡情况。8.统计学分析:实验数据用SPSS11.0统计软件包进行统计学处理。两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析,数据用（（?）±s）表示,α=0.05作为差别有显著性的检验水准。结果:1.经过一系列相关考察验证,证实NGR/LPD是形态规整的近球形复合物,平均粒径在178nm左右,平均zeta电位近中性;可长期稳定存放;对ASODN的包裹效果好;具备NGR多肽的肿瘤靶向修饰。2.体内分布实验结果显示:四种制剂经静脉注射进入体内后都部分地被肝、肾、肺和脾等脏器摄取、截留,但在瘤体中的它们的分布情况则明显不同:ASODN、PEI/ASODN和LPD组瘤体组织中仅能观察到微弱的荧光,而在NGR/LPD组裸鼠瘤体中的荧光强度则明显强于前三组,而且注射后1、3、6小时三个时间点观察其荧光强度在逐步增强,表明NGR/LPD复合物可以有效进入到瘤体组织,而且会不断地向瘤体组织富集。3.移植瘤的生长情况观察:药物治疗3周后,观测NGR/LPD组的瘤体生长明显受到抑制,与其它各组具有显著差异。4.免疫组织化学结果:与生理盐水组相比较,NGR/LPD组hTERT蛋白表达明显降低（P＜0.01,P＜0.05）,高、低剂量组间存在明显差异（P＜0.05）。NGR/LPD与LPD、PEI/ASODN相同剂量组间比较有明显差异（P＜0.05）。LPD、PEI/ASODN缩合体组染色得分值虽然不同程度降低,但无统计学意义（P＞0.05）,ASODN和正义组与空白对照对比无明显差异（P＞0.05）。NGR/LPD高剂量组C-myc蛋白表达明显升高（P＜0.05）、Bcl-2表达则明显降低（P＜0.05）,NGR/LPD低剂量组C-myc及Bcl-2蛋白表达变化不明显（P＞0.05）,NGR/LPD高、低剂量组间存在明显差异（P＜0.05）,其余各组变化均无统计学意义（P＞0.05）。5.各组瘤组织hTERT mRNA检测结果:NGR/LPD组hTERT mRNA水平与生理盐水组比较明显降低（P＜0.01,P＜0.05）,且高、低剂量组间比较有显著性差异（P＜0.05）。PEI/ASODN、LPD高剂量组灰度值有不同程度降低,但无统计学意义（P＞0.05）。NGR/LPD与LPD、PEI/ASODN相同剂量组间比较有明显差异（P＜0.05）。ASODN和正义组与空白对照对比无明显差异（P＞0.05）。6.细胞凋亡率检测结果:各对照组偶见或少见凋亡细胞,NGR/LPD复合物高剂量组和NGR/LPD低剂量组凋亡细胞明显增多,凋亡指数明显增多（P＜0.01,P＜0.05）,NGR/LPD高剂量组可见TUNEL染色阳性细胞呈小片状分布。NGR/LPD高、低剂量组间比较有明显差异（P＜0.05）。NGR/LPD与LPD、PEI/ASODN相同剂量组间比较有明显差异（P＜0.05）。LPD、PEI/ASODN缩合体组得分值有不同程度升高,但无统计学意义（P＞0.05）,ASODN和正义组与空白对照对比无明显差异（P＞0.05）。7.对瘤体组织HE染色进行镜下观察时发现:对照组瘤细胞生长活跃,可见瘤巨细胞,散在有点、片状坏死灶。实验（NGR/LPD高剂量）组可见瘤细胞瘤细胞间质纤维化较明显,可见大片坏死灶。在对裸鼠各脏器HE染色进行镜下观察时发现:PEI/ASODN高剂量组部分裸鼠肺泡腔内可见大量浆液渗出,肺泡隔变宽。PEI/ASODN低剂量组及其它各组未见异常。结论:1.本研究制备的复合型肿瘤靶向脂质复合物（NGR/LPD）具有粒径小、均一、无毒,对ASODN包封效果好,能够稳定保存等特点。2.以hTERT为靶点人工合成的ASODN可特异地抑制hTERT mRNA的表达和端粒酶活性,诱导肿瘤细胞凋亡。3.NGR/LPD能够随着血液循环靶向运载ASODN到达靶组织肿瘤细胞内,可以有效抑制移植瘤的生长,且其抑制作用具有明显的剂量依赖性。研究发现抑制hTERT的表达,下调端粒酶的活性,可引起C-myc蛋白表达量增加,使Bcl-2的表达受到抑制。4.NGR/LPD在体内显示出了较好的肿瘤靶向性和理想的抗肿瘤活性,具有肿瘤基因治疗的应用前景。