【摘 要】
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目的:探究内源性TIGAR在心肌缺血再灌注损伤中的作用,以及外源性给予一定浓度的NADPH是否具有心肌保护作用和可能机制的研究。方法:第一部分 利用雄性SD大鼠建立在体原位开胸
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目的:探究内源性TIGAR在心肌缺血再灌注损伤中的作用,以及外源性给予一定浓度的NADPH是否具有心肌保护作用和可能机制的研究。方法:第一部分 利用雄性SD大鼠建立在体原位开胸心肌缺血再灌注(I/R)损伤模型,实验随机分5组(n=6):假手术组(Sham组),缺血30分钟组(I30组),缺血60分钟组(160组),缺血30分钟再灌注60分钟组(I30R60组),缺血30分钟再灌注120分钟组(I30R120组)。在不同时间节点采用Western blot法检测内源性TIGAR及GAPDH蛋白表达水平。采用TIGAR全身性敲除小鼠(KO组)和野生型小鼠(WT组),用试剂盒检测心肌组织中的NADPH水平,以及用Western blot法检测心肌组织中TIGAR,P62,LC31/Ⅱ和GAPDH蛋白表达水平。第二部分雄性SD大鼠随机分成6组:假手术组(Sham组),模型溶媒组(Vehicle+I/R组),外源性给予不同浓度(4mg/kg,8mg/kg 和 16mg/kg)的 NADPH 组(N4+1/R 组,N8+1/R 组和N16+I/R组)和地尔硫卓组(Diltiazem+1/R组)。采用patent blue和TTC双重染色法检测缺血30分钟再灌注2小时后各组的心肌梗死面积(n=6)。另检测缺血30分钟再灌注4小时后Sham组,Vehicle+IR组,N16+IR组和Diltiazem+IR组血清中的乳酸脱氢酶(LDH)和心肌肌钙蛋白I(cTn-I)的浓度以及心肌组织中的ATP浓度(n=6)。同时Western blot法测缺血30分钟再灌注2小时后各组不同处理对LC3BI/Ⅱ,P62,PINK1,PARKIN等蛋白表达水平的影响(n=6);共聚焦显微镜测ROS的变化;HE染色测心肌结构的改变。结果:第一部分 与Sham组比较,130组,160组以及130R60组TIGAR表达水平明显升高(P<0.05);但是I30R120组与Sham组比较无统计学差异(P>0.05),提示TIGAR主要在心肌缺血阶段上升,在再灌注阶段随着时间的推移而缓慢下降。与WT组比较,KO组NADPH含量明显下降(P<0.01);LC3Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白表达水平均上升,提示TIGAR敲除后影响心肌的NADPH含量进而使自噬流受阻。第二部分与Sham组比较,Vehicle+1/R组心肌梗死面积明显增大;与Vehicle+1/R组比较,N8+I/R组,N16+I/R组和Diltiazem+I/R组梗死面积显著减小(P<0.05),但是N4+I/R组无统计学差异(P>0.05)。与Sham组比较,Vehicle+IR组血清LDH和cTn-I浓度均升高;与Vehicle+IR组比较,N16+IR组和Diltiazem+IR组血清LDH和cTn-Ⅰ浓度均明显下降;ATP浓度四组间无统计学差异(P>0.05)。与Sham组比较,Vehicle+1/R组LC3BⅡ/Ⅰ,P62,PARKIN 蛋白表达上调(P<0.05);NADPH 处理后 LC3BⅡ/Ⅰ,P62,PARKIN 蛋白表达恢复正常;PINK1表达水平各组间无差异(P>0.05)。NADPH处理后使缺血再灌注损伤ROS量减少,心肌组织结构有一定程度恢复。结论:在心肌缺血再灌注损伤期间,内源性TIGAR表达上调从而使心肌组织中NADPH的含量增加,是其产生心肌保护作用的可能机制;外源性给予一定浓度的NADPH(8mg/kg或16mg/kg)能减轻心肌缺血再灌注损伤,其机制可能与减少ROS和恢复自噬流通畅有关。
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