糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是一种常见和严重的以微血管病变为主的糖尿病并发症,是终末期肾病(end-stage renal disease, ESI(?)D)的主要原因之一,我国的发病率呈逐年上升趋势。其发病原因和病理机制仍不明确,大部分的研究认为与高血糖、血流动力学改变、遗传和环境因素、性别因素、糖尿病持续时间等密切相关。近年来研究发现T细胞过度活化以及炎性浸润是糖尿病肾损伤的主要免疫病理机制。而表观遗传在调节T细胞基因表达以及细胞分化成熟、活化中起重要作用。表观遗传学(epigenetics)是20世纪80年代逐渐兴起的新兴学科,是指在基因编码的DNA序列不变的前提下,通过某些机制产生可遗传的基因表达或细胞表型的改变。其主要机制包括DNA甲基化(DNA methylation)、组蛋白修饰(Histone Modification)和小RNA干扰(microRNA interference)等。其中组蛋白乙酰化是最重要的修饰之一,是基因表达的主要驱动力。组蛋白的乙酰化修饰是在组蛋白乙酰化酶(Histone acetyltransferase, HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetyltransferase, HDACs)的共同调节下维持动态平衡,并与基因的转录激活密切相关。转录活跃区域的核心组蛋白乙酰化程度高,而转录关闭区域核心组蛋白乙酰化程度低。HAT能乙酰化核心组蛋白,使相关区域的染色质结构松散,起始转录；HDAC能去除核心组蛋白的乙酰化修饰,使相关区域染色质超螺旋,抑制RNA聚合酶以及相关转录因子与DNA的结合,关闭转录。HDACs与HATs的功能相反,能通过去除组蛋白乙酰化修饰来关闭转录。人类中已发现的HDACs共有18种,根据与酿酒酵母的三种HDACs (apd3、Hdal和Sir2)的同源性可分为三类：第1类与酵母的apd3同源且结构相近,包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC11;第2类与酵母Hdal有相近的催化结构,又可分为A亚类和B亚类,ⅡA类是转录共遏制因子(Corepressor),包括HDAC4、HDAC5、HDAC7、 HDAC9。ⅡB类包括]HDAC6、HDAC10。第2类与第1类催化活性相近,但结构和功能上却明显不同；第3类与酵母中的Sir2同源,目前已鉴定出7种,分别为SirT1-7。随着研究的不断推进,大量我们已经了解和明确的分子机制牵涉进糖尿病并发症特别是DN的病理机制中。蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)是现在公认的导致糖尿病肾损伤的重要信号分子。大量促炎症因子和促纤维化因子例如：转化生长因子(transforming growth factor-b1, TGF-b1),结缔组织生长因子(connective tissue growth factors, CTGF),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白等在糖尿病患者肾脏表达上调。内源性抗纤维化细胞因子骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein-7, BMP7)和E-钙粘蛋白的表达降低。多种促或抗纤维化相关基因在DN患者肾脏细胞的异常表达提示我们,可能有某种上游分子机制的失衡影响了相关基因的表达。组蛋白去乙酰化酶(]HDAC)可以通过调节组蛋白的乙酰化水平调控基因转录。有研究表明HDAC抑制剂能有效保护DN患者的肾脏,明显缓解临床症状。提示我们HDAC表达异常可能参与到DN的病理过程中。通过比较非肥胖型糖尿病小鼠(non-obese diabetic mouse, NOD)发病前后的肾脏病理,发现发病后的NOD鼠肾小球中有T、B和CD11c+树突状细胞浸润,并伴有IgG和补体C3的沉积。此外,从NOD鼠的血清中可以检测到抗自身肾小球成分的自身抗体。而这些现象在未发病的非糖尿病NOD小鼠中未观察到。可见,糖尿病肾病的发生与免疫细胞的功能异常密切相关。本研究前期试验发现,与正常对照相比1型糖尿病患者CD4+T细胞组蛋白H3,H4乙酰化明显降低,HDAC5表达水平显著升高,且H3乙酰化降低水平与患者血糖水平明显负相关。提示我们CD4+T细胞总体组蛋白低乙酰化以及HDAC5表达异常升高可能导致其功能异常,进而参与到糖尿病及糖尿病肾病的发病机制中。本课题选用糖尿病模型NOD鼠为研究对象,通过检测NOD鼠发病过程中CD4+T细胞总体H3,H4乙酰化水平以及HDACs的改变,并与相关指标做相关性分析,进一步明确CD4+T细胞组蛋白乙酰化修饰异常与DN发生发展之间的关系。第一部分脾脏CD4+T细胞组蛋白乙酰化修饰与NOD鼠糖尿病肾病发病的关系第一节不同周龄NOD鼠脾脏CD4+T细胞H3,H4总体乙酰化水平和相关修饰酶谱的研究目的：检测不同周龄NOD鼠脾脏CD4+T细胞H3,H4总体乙酰化水平和相关修饰酶谱。方法：将NOD鼠进食饮水自由随机分为4组,于12,18,24和30周取NOD小鼠脾脏分离CD4+T细胞,抽提组蛋白,总RNA和总蛋白。用美国Epigentek公司的H3,H4总体乙酰化ELISA试剂盒检测NOD鼠CD4+T细胞组蛋白H3,H4总体乙酰化水平。实时定量PCR(Real Time PCR)检测NOD鼠脾脏CD4+T细胞组蛋白乙酰化相关修饰酶的mRNA水平。Western Blot进一步验证Real Time PCR筛选出的阳性基因,并将异常表达的修饰酶与H3,H4乙酰化做相关性分析。明确NOD鼠脾脏CD4+T细胞H3,H4乙酰化的修饰状态,探讨其与DN的相互关系。结果：通过检测我们发现,随着疾病的发展24和30周龄NOD鼠脾脏CD4+T细胞H3,H4总体乙酰化水平明显低于12周龄小鼠,而且周龄越大H3,H4总体乙酰化水平越低。18周龄鼠H3,H4总体乙酰化水平略低于12周龄鼠。Real Time PCR检测乙酰化相关修饰酶发现与12周龄NOD鼠相比,24周龄和30周龄鼠P300, PCAF, HDAC2mRNA水平明显下降,而HDAC5mRNA水平则显著性升高,CREBBP表达水平无变化。18周龄NOD鼠与12周龄鼠相比仅]HDAC5mRNA水平略有升高,其余无显著性差异。Western Blot结果显示24和30周龄NOD鼠脾脏CD4+T细胞HDAC5蛋白表达水平明显高于12周龄鼠。结论：随着NOD鼠疾病的进展,其脾CD4+T细胞总体H3,H4乙酰化水平明显降低,组蛋白去乙酰化酶HDAC5表达水平明显升高,且二者呈显著负相关。第二节NOD鼠CD4+T细胞异常的组蛋白乙酰化修饰与糖尿病肾病相关指标的关系目的：检测不同周龄NOD小鼠随机血糖和微量尿白蛋白排泄量,并与对应的CD4+T细胞H3,H4总体乙酰化水平和HDAC5水平做相关性分析,明确CD4+T细胞中HDAC5表达水平与DN的关系。方法：每周用血糖仪和试纸检测NOD小鼠的随机血糖,取12,18,24和30周每只NOD小鼠血糖记录分析。提尾反射法收集各周龄小鼠尿液,美国RB公司的ELISA试剂盒分别检测尿白蛋白和肌酐,计算尿白蛋白/肌酐比率得出尿白蛋白排泄率。结果：与12周龄鼠相比24和30周龄鼠血糖浓度以及尿白蛋白/肌酐比率显著升高,18周龄NOD鼠血糖略有升高,尿白蛋白/肌酐比率无明显变化。24和30周龄鼠H3, H4乙酰化水平与尿白蛋白/肌酐比率显著负相关,HDAC5水平与尿白蛋白/肌酐比率显著正相关。结论：CD4+T细胞中HDAC5的异常升高与NOD鼠肾功能的损害密切相关。第二部分siRNA表达质粒干扰组蛋白去乙酰化酶HDAC5的表达目的：利用siRNA技术构建HDAC5的干扰质粒,筛选出有效干扰靶点,为后期干预NOD鼠脾脏CD4+T细胞做准备。方法：根据genebank提供的HDAC5mRNA序列,使用ambion提供的在线设计工具BLOCK-iTTM RNAi Designer查找干扰靶点。将待选靶序列克隆进pLKD.CMV.G&PR.U6.shRNA质粒,并将克隆成功的质粒电转染小鼠CD4+T细胞,Real Time PCR和Western Blot检测干扰效率,筛选出有效靶点。结果：利用BLOCK-iTTM RNAi Designer找出4条评分最高的HDAC5干扰靶点,并成功克隆进干扰载体。通过Real Time PCR和WesternBlot检测出siRNA-HDAC5-2干扰效果最好。结论：siRNA技术可成功干预小鼠CD4+T细胞HDAC5的表达。第三部分siRNA-HDAC5对NOD鼠组蛋白修饰异常的干预及其治疗作用目的：通过干预NOD鼠脾脏CD4+T细胞HDAC5的表达,检测肾功能相关指标,评估siRNA-HDAC5对NOD鼠的治疗作用,进一步明确HDAC5与DN之间的关系。方法：将小鼠随机分为三组,即siRNA-HDAC5, siRNA-Control和生理盐水组。于18,24和30周龄取样本检测。Real-time PCR检测各组NOD鼠CD4+T细胞CD11a、CCR5、以及CX3CR1转录水平。ELISA检测各组NOD鼠血清IL-1, IL-6, IL-18和TNF-α水平。血糖仪检测各组NOD鼠血糖,ELISA检测各组NOD鼠尿白蛋白排泄率。最后常规病理检测各组NOD鼠肾脏。结果：与未干预对照组相比,HDAC5干预组小鼠脾CD4+T细胞CD11a、CCR5、以及CX3CR1明显降低。血清IL-1, IL-6, IL-18, TNF-α细胞因子水平,以及血糖和尿白蛋白排泄率均显著降低。肾脏病理结果显示与对照组相比,干预组24周龄鼠肾小球病理损伤无明显改变,30周龄鼠仅可见系膜细胞轻度增生,基质略有增多,中性粒细胞浸润较少,基底膜未见明显增厚；间质内少量炎症细胞浸润,肾小管细胞未见明显纤维化。结论：阻断CD4+T细胞HDAC5的表达能减缓糖尿病鼠肾损的发生和发展。