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研究目的:本研究拟观察益气健脾方剂黄芪六一汤对2型糖尿病模型大鼠的治疗作用,探讨其可能通过影响由SGLT2/GLUT2介导的肾小管上皮葡萄糖重吸收的作用机制;本研究从肾脏葡萄糖重吸收观察黄芪六一汤的作用,为中药防治糖尿病的研究尝试新的方法,并且可为探讨黄芪六一汤益气健脾利尿在糖尿病中的治疗应用提供科学依据。研究方法1、采用高脂高糖喂养合并腹腔注射链脲佐菌素复制2型糖尿病大鼠模型。观察实验大鼠一般症状,检测实验动物空腹血糖、糖化血红蛋白、胰腺及肾脏组织病理学观察,比较观察25mg/kg,30mg/kg,35mg/kg,40mg/kg四种不同剂量STZ腹腔注射的造模效应,筛选最适宜的STZ腹腔注射剂量,并了解该大鼠糖尿病模型的发.生、发展变化过程,为后续研究奠定基础。2、复制2型糖尿病大鼠模型,分别给予达格列净0.5mg/kg,黄芪六一汤3.15g/kg、6.30g/kg、12.60g/kg灌胃治疗,观察黄芪六一汤对糖尿病大鼠的一般状态包括体重、摄食量、空腹血糖,并于给药6周后,取血检测糖化血红蛋白、血脂4项、血浆胰岛素,留取肾脏、胰腺组织用于组织病理学检查及肾组织中SGLT2、GLUT2蛋白表达及mRNA表达。3、分别采用免疫组化和western blot方法观察模型组和各治疗组对大鼠肾小管上皮SGLT2及GLUT2蛋白表达的影响。4、荧光定量PCR方法检测观察各组大鼠肾脏组织中slc5a2及slc2a2基因表达的差异。5、综合上述研究结果分析探讨黄芪六一汤的疗效及其可能通过调节经SGLT2/GLUT2的肾小管上皮葡萄糖重吸收的作用机制。研究结果1、通过比较研究发现,高脂高糖饲料喂养4周后,30mg/kg体重剂量给予大鼠一次性腹腔注射STZ,能造成类似2型糖尿病的大鼠动物模型,该动物模型较为稳定。空腹血糖>11.1 mmol/L,造模成功率高,而且其损伤相对较轻,腹腔注射后6周内未见动物死亡,30mg/kg剂量STZ较适宜本研究应用。2、成功复制了 2型糖尿病大鼠模型,造模组大鼠见有明显多饮、多食、多尿、体重减轻"三多一少"的症状",同时出现大便溏稀、毛发脱落,喜卧懒动等类似脾虚症状;血糖及糖化血红蛋白明显升高;造模大鼠胰岛结构尚且清晰可见;HE染色观察各组大鼠的肾脏肾小球、集合小管、近端小管及远端小管的结构完整,并无明显实质性病理损害;造模大鼠血浆胰岛素水平未见明显改变。造模组大鼠经过6周的黄芪六一汤灌胃治疗,脾虚大鼠的一般症状有所好转;血糖及糖化血红蛋白等指标均优于模型对照组;大鼠造模、给药均未对血脂造成明显影响。3、免疫组织化学方法观察结果表明,高脂高糖饮食合并STZ腹腔注射致糖尿病大鼠模型肾小管中SGLT2及GLUT2表达增高,黄芪六一汤灌胃治疗6周后有一定程度降低其蛋白表达的作用;Western Blot检测肾脏组织中的SGLT2、GLUT2蛋白表达结果发现,模型组大鼠肾脏SGLT2表达增高,黄芪六一汤治疗后表达量减少;模型组大鼠肾脏组织中GLUT2表达降低,黄芪六一汤治疗后其蛋白表达升高。4、qPCR研究结果表明,与模型组对比,黄芪六一汤没有提高肾组织slc5a2基因表达的趋势;与模型组对比,黄芪六一汤低剂量、黄芪六一汤中剂量对slc2a2基因表达有上调的作用趋势,但没统计学意义。研究结论黄芪六一汤对实验性糖尿病大鼠具有较好的治疗作用,可以降低实验性糖尿病大鼠的血糖、糖化血红蛋白。高糖高脂饮食合并腹腔注射链脲佐菌素致糖尿病大鼠肾组织SGLT2及GLUT2表达增高,导致糖尿病模型大鼠肾小管上皮SGLT2、GLUT2表达增加的可能原因是因为模型动物血糖升高,肾小球滤过的葡萄糖量增加,进而导致需要从肾小管上皮葡萄糖的重吸收量增加。本课题研究结果表明黄芪六一汤对糖尿病大鼠肾组织中SGLT2蛋白表达有一定的调节作用。黄芪六一汤降血糖的效应可能部分由于其调控肾小管上皮经SGLT2的葡萄糖重吸收而起效。