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沙棘,别名醋柳,可结出橙黄色的小浆果,除食用之外还可以用于治疗疾病。研究表明,沙棘中的多酚种类多、含量高,具有抗氧化、消炎、增强免疫力、保护心脑血管及抑癌等作用。沙棘作为山西的特色资源,其中的野生沙棘资源在全国的占比超过70%,但如此丰富的资源仍未被充分利用。数据显示,癌症发病和致死病例逐年增加,且中国的发病率和致死率位列全球首位。研究表明肿瘤细胞往往改变能量代谢途径以应对缺氧和低营养的微环境,同时提供大量的中间代谢产物以满足其快速增殖的需求。肿瘤细胞摄取的葡萄糖主要依赖于PKM2依赖的有氧糖酵解途径来代谢,在此过程中PKM2往往比正常细胞中的表达要高,因此针对PKM2的干预调控不失为治疗癌症的一种有效策略。PKM2的表达受剪切因子hnRNP蛋白(hnRNPA1、hnRNPA2、PTBP1)的调控,经过PKM基因的mRNA选择性剪切过程生成。hnRNP蛋白高表达有利于PKM2的生成,促进肿瘤的代谢增殖。研究表明,沙棘多酚在抑制肿瘤增殖方面有显著的效果,但其发挥抗肿瘤作用的活性成分及分子机制尚不清楚。因此,本研究从新鲜的沙棘果中提取结合态多酚,分离鉴定了其中的多酚成分,并探讨其通过逆转PKM选择性剪接介导的肿瘤糖酵解发挥抗结肠癌效应的具体分子机制。研究内容和结果包括以下几方面内容:(1)确定沙棘不同部位具有显著抗肿瘤活性的多酚。分别从沙棘植物的不同部位(果、叶和籽)提取多酚,游离态部分用有机试剂提取,结合态部分用碱消化法提取。结果发现沙棘果结合态多酚具有显著的抗结肠癌活性。紧接着对沙棘果多酚提取过程中的提取溶剂和水解方法进行了选择,最终确定了80%乙醇和碱消化法分别提取沙棘果自由态多酚和结合态多酚。(2)探讨了沙棘果结合态多酚的多酚成分及抗结肠癌效应。经大孔吸附树脂HPD600初步纯化,LC-MS方法分离和鉴定了其中的8种多酚成分,包括酚酸类化合物芥子酸、阿魏酸、对香豆酸、7-羟基香豆素和黄酮类化合物山奈酚、山奈酚-3-O-β-吡喃葡萄糖-7-O-α-鼠李糖苷、阿福豆苷及5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-3-yl-6-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)hexopyranoside。通过MTT法、WB实验及流式分析,发现沙棘果结合态多酚可诱导结肠癌细胞凋亡、G1期阻滞来抑制结肠癌的生长。(3)明确沙棘果结合态多酚重塑PKM2介导的有氧糖酵解发挥抗结肠癌效应的分子机制。实验表明沙棘果结合态多酚可降低葡萄糖的消耗、乳酸和ATP的生成,从而影响糖酵解过程。采用western blot检测PKM1、PKM2及剪接因子hnRNPA1、hnRNPA2、PTBP1的表达,发现PKM1表达升高,PKM2及剪接因子PTBP1的表达显著下降,表明沙棘果结合态多酚调控PKM的选择性剪接。miRNAs参与了体内超1/3蛋白编码基因的调控,包括PTBP1蛋白。于是采用qPCR比较沙棘果结合态多酚处理和未处理的肿瘤细胞中PTBP1上游miRNAs的水平,发现处理后的结肠癌细胞中miR-339-5p的水平升高,进一步将其mimic和inhibitor转染结肠癌细胞,发现miR-339-5p的表达水平与结肠癌细胞中PKM2、PTBP1的表达水平呈负相关。最后在双荧光素酶报告实验中的结果显示miR-339-5p可直接与PTBP1的3’UTR区结合,进而抑制PKM2的表达。综上所述,此研究分离鉴定了沙棘果结合态多酚中的抗肿瘤活性成分,并阐明其通过miR-339-5p/PTBP1/PKM2信号轴重塑肿瘤糖代谢,进而发挥抗肿瘤活性的分子机制,该研究为更充分利用沙棘资源奠定了理论基础,并为以干预PKM2参与的代谢调控治疗癌症提供新思路。