论文部分内容阅读
干旱是限制作物产量的重要逆境之一,我国大部分麦区干旱发生频繁,严重影响粮食生产安全。解析小麦抗旱分子机理并深入挖掘抗旱相关基因,对于改良小麦抗旱性、发展节水农业具有重要的理论和实践意义。本试验选用两个抗旱性存在显著差异的小麦品种（系）（抗旱小麦品种西农979（XN979）和干旱敏感品系（LA-379））,设置干旱和正常灌水两个处理,测定叶片相对含水量、叶片电导率、叶片丙二醛（MDA）含量和叶片脯氨酸含量;通过蛋白组学分析解析其抗旱的分子机理;利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术对筛选获得的2个差异蛋白W5DYH0和W5ERN8对应的编码基因进行沉默,对其功能进行研究。主要试验结果如下:1、抗旱小麦品种XN979和干旱敏感品系LA-379抗旱性鉴定研究表明,相比于正常灌水处理,干旱处理下XN979的小麦叶片相对含水量仅下降了8.4%,与对照相比未达到显著水平,而LA-379的叶片相对含水量降低了40.4%,达到了极显著水平;相比于正常灌水处理,干旱处理下XN979的叶片相对电导率仅升高了20.1%,而LA-379小麦品种中的干旱处理的小麦叶片的相对电导率升高了70.1%,达到了极显著水平;相比于正常灌水处理,干旱处理下XN979的小麦叶片MDA含量升高了74.0%,而LA-379小麦品种中的干旱处理的小麦叶片MDA含量则升高了169.6%,明显高于XN979;干旱处理下XN979的脯氨酸含量升高了241.6%,而LA-379小麦品种中的干旱处理的小麦叶片脯氨酸含量升高了103.8%。干旱处理下,XN979的小麦叶未出现明显的小麦叶片下垂和卷曲的表型,而LA-379小麦叶片出现明显的叶片下垂和卷曲的表型。说明XN979比LA-379小麦品种抗旱性强。2、利用比较蛋白组学分析手段对抗旱小麦品种XN979和干旱敏感品系LA-379在正常灌水和干旱条件下叶片的差异表达蛋白进行了研究。共获得二级质谱图谱总数:227076;鉴定肽段匹配到的谱图数:38070;鉴定到的肽段总数:17416;鉴定到的唯一肽段总数:12126;鉴定到的蛋白质总数:5369。XN979小麦品种中鉴定出482个差异蛋白,199个上调的差异表达蛋白,283个下调表达蛋白;LA-379小麦品种中鉴定出600个差异表达蛋白,其中301个上调表达蛋白,299个下调表达蛋白。XN979小麦品种中鉴定出335个特有差异表达蛋白,LA-379小麦品种鉴定出453个特有差异表达蛋白,鉴定出147个两个小麦品种共有的差异表达蛋白。XN979小麦品种中特有的差异表达蛋白主要参与了代谢通路、次生代谢产物的生物合成、碳代谢、光合作用、光合生物体中的碳固定、乙醛酸和二羧酸代谢、糖酵解/糖异生等通路。为评价蛋白组学数据的可靠性,选择12个差异蛋白,分别用Ta GAPDH基因和Ta Actin基因作为内参基因,用Real time-PCR验证其在转录水平的表达量。结果显示,利用两个不同内参基因得到的研究结果基本一致。大部分差异表达蛋白的蛋白表达水平和转录水平表达趋势一致,而其余的蛋白水平和转录水平的相关性比较差,说明这些基因的表达可能存在转录、转录后、翻译和翻译后水平上的调控。3、利用VIGS技术对挑选出的2个差异表达蛋白编码的基因的功能开展了进一步研究。差异蛋白W5DYH0的编码基因命名为Ta DSR1（Drought stress response 1）,差异蛋白W5ERN8编码的基因命名为Ta DSR2（Drought stress response 2）。VIGS接种后第10天,BSMVPDS植株出现白化症状,沉默基因的植株的第3片叶片上出现斑点条纹的感染表型,说明侵染成功。对接种成功的植株中差异表达蛋白编码的基因的m RNA量的检测结果表明,相比于正常灌水（NS）,Ta DSR1和Ta DSR2两个基因在干旱处理下（DS）的m RNA的表达水平和接种γ空载体阴性对照（BSMV0）干旱处理植株的m RNA的表达水平都显著升高,靶基因减量表达植株中,不同株系m RNA的表达水平均显著下调。说明干旱胁迫能诱导该基因上调表达,而VIGS技术沉默该基因后,又降低了其表达量,在干旱胁迫下处于较低的表达水平。对接种成功的植株中差异表达蛋白对应基因的生理指标的检测结果表明,相比于正常灌水处理（NS）,干旱处理下,XN979和ZM9023两个小麦品种的干旱处理（DS）、接种γ空载体阴性对照的干旱处理（BSMV0）和沉默Ta DSR1和Ta DSR2两个基因的不同株系的叶片相对含水量均显著下降,但与干旱处理（DS）相比,靶基因减量表达植株中,不同株系叶片相对含水量均显著下调;相比于正常灌水处理（NS）,干旱处理下,XN979和ZM9023两个小麦品种的干旱处理（DS）、接种γ空载体阴性对照的干旱处理（BSMV0）和沉默Ta DSR1和Ta DSR2两个基因的不同株系的叶片相对电导含量和MDA含量均显著升高,与干旱处理（DS）相比,靶基因减量表达植株中,不同株系叶片相对电导含量和MDA含量也均显著升高;相比于正常灌水处理（NS）,干旱处理下,XN979和ZM9023两个小麦品种的干旱处理（DS）、接种γ空载体阴性对照的干旱处理（BSMV0）和沉默Ta DSR1和Ta DSR2两个基因的不同株系的叶片脯氨酸含量均显著升高,与干旱处理（DS）相比,靶基因减量表达植株中,不同株系叶片脯氨酸含量均显著降低,叶片出现下垂。结果表明干旱胁迫能诱导Ta DSR1和Ta DSR2两个基因上调表达和生理指标的变化,而VIGS技术沉默这两个基因后,又降低了这两个基因的表达量并改变了生理指标,进而导致其抗旱性减弱。说明Ta DSR1和Ta DSR2在小麦抗旱中发挥了重要作用。