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腺病毒载体（Adenoviral vector）是目前重要的基因转移载体之一。作为真核基因表达载体，腺病毒载体可装载长达7.5kb的外源DNA，复制效率高，制备高滴度病毒粒子较简便；腺病毒具有广泛的宿主系统，既能感染分裂细胞也能感染非分裂细胞，并且不和宿主染色体整合，因而比较安全。腺病毒载体的这些优点使它在基因治疗研究和临床试验中备受青睐，显示出极强的生命力。 细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）与细胞迁移、粘附、增殖和新生血管形成有密切关系。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）和其组织抑制因子（Tissue Inhibitor of Metalloproteinases, TIMPs）是一对参与ECM代谢的重要酶和酶抑制物，它们的调节失衡可导致肿瘤的发生和转移。通过腺病毒介导MMPs的天然或合成抑制剂来抑制肿瘤新血管的生成，从而阻断肿瘤的浸润和转移可能成为肿瘤基因治疗的新方法。 本研究选择MMPs的天然抑制物之一---TIMP1为研究对象，以高效、安全的重组腺病毒为载体，研究TIMP1高表达对肝癌细胞BEL-7402黏附、转移和增殖的影响，以探讨TIMP1作为抗血管生成基因参与治疗恶性肿瘤的理论基础。1．携带人TIMP1腺病毒载体的构建 参照He等（1998）细菌内同源重组系统构建人TIMP1的重组腺病毒载体pAd1／TIMP1，重组质粒经酶切鉴定正确后以磷酸钙沉淀法转染QBI-293A细胞进行包装。由于该系统带有GFP为标志基因，在荧光显微镜下可以方便地观察病毒的包装过程。包装完成后，用反复冻融法制备病毒上清，并用PCR和Western blot检验了TIMP1的正确携带和表达，测定病毒上清滴度为1×107--108efu／ml，在293A细胞扩增浓缩后经CsCl梯度离心，病毒滴度可达1×1012--1013efu／ml。成功获得了重组腺病毒Ad1／TIMP1，为下一步应用于肝癌的细胞实验提供了基础。2．TIMP1对肝癌细胞BEL-7402的黏附、迁移的影响 Ad1／TIMP1感染肝癌细胞BEL-7402后用Western blot和ELISA检测了TIMP1的过表达。BEL-7402在感染Ad1／TIMP1后48h通过胰蛋白酶消化细胞并以相同密度分别接种于已包被纤粘连蛋白（fibronectin, FN）、Ⅰ型胶原（collagen 硕士学位论文 摘 要 1）和无包被的96孔培养板，37t、5％CO。培养Zh后将细胞振荡lh，用PBS洗 去漂浮细胞，新附细胞以MTT快速比色计量法检测细胞数目。结果发现：BEL7402 在加入 FN、COil底物上培养，其措附能力均比对照组增强，FN对 7402 ＄t附力 的诱导远远大于 COil。TIMPI的高表达能增强 7402在各种基质上的附着能力， 在FN和空白基质上，感染Ad／TIMPI组的附着细胞数分别比对照组（Adl）增加 22％和 28％，而在COil基质上，Adl／TIMPI组的细胞载附力增加幅度较低，为 6％。 细胞的迁移实验采用了琼脂滴方法和划线法来研究整体细胞向周围空间迁 移扩散的能力，实验显示BEL－7402在感染Adl／TIMPI后sd内，迁移能力有很明 显的下降，与对照组＊ 相比，分别下降了 52％和 62％，结果经 t检验具有显著 差异（P＜0．05）。这些实验结果表明：在肝癌细胞系BEL－7402中，TIMPI也有抑 制浸润、迁移的作用。 3．TIMPI对肝癌细胞朋L－7402的生长影响 TIMPI在许多肿瘤中的表达都是组成性增高的，而且，对于TIMPI参与怎样 的细胞周期调控一直存在不同的意见。我们采用了MTT、流式细胞术等实验手段， 观察TIMPI高表达时，BEL－7402的生长增殖和细胞周期是否受到影响。MTT结果 发现：TIMPI对mL刁402的生长有 2一90程度的下降，但无统计学差异。流式细 胞仪检测细胞周期的变化也显示了类似的结果：G／＊略微上升，而 GZ／M期有 所降低，但幅度都不大。TIM卜1几乎不影响或者说只有轻微抑制BEL－7402细胞 的有丝分裂和减缓细胞周期的作用。 4．另外，利用细菌同源重组系统，还构建了5个重组腺病毒载体 构建的载体有：PAd1STAT3（WT），PAd1STAT3（CYF），PAd1TCF4， pAdl－dnTCF4，pAd16 catenin。汪：STAT（signal transducers and actlvators of transcription）：信号转导及转录活化因子；WT：野生型：CYF：优势负性突 变体。