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还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)是γ-谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽,临床广泛应用于保护和恢复肝功能、防止色素沉积、放化疗、低氧血症、早期老年白内障、角膜炎症、过敏、中毒的辅助治疗等。近年研究发现,体内GSH及其与氧化型谷胱甘肽(oxidated glutathione,GSSG)比值的变化与许多疾病均有密切联系,市场极为广阔。目前,酵母发酵法为国内外常用的GSH工业生产法,工艺较成熟。生产过程中GSH的关键质量属性主要包括:GSH含量、水分以及半胱酰甘氨酸、半胱氨酸、GSSG、L-谷氨酰基-4-硝基苯胺等有关物质的含量。其中,影响产品质量的关键质量属性有发酵物中GSH的含量、GSH干燥后的水分含量以及GSH中GSSG的含量三个主要方面。目前发酵终点判断GSH和GSSG含量检测的常规方法均为HPLC法,而水分含量测定方法为烘箱干燥法。以上检测方法因步骤较为繁琐、分析时间长而成为制约产品质量的快速放行的瓶颈。因此,本研究引入近红外光谱分析技术(near infrared spectroscopy,NIRS)对提高GSH生产和质控效率具有重要的研究意义。本研究利用近红外光谱分析方法实现GSH生产过程中关键质量属性的快速无损检测,建立了GSH关键质量属性的分析模型。主要包括:GSH发酵过程中GSH含量的快速检测;GSH中水分含量的快速检测;GSH产品中GSSG含量的快速检测技术研究。具体研究内容如下:(1)NIRS用于GSH发酵过程中含量变化的快速检测研究对GSH发酵过程中的发酵液进行取样,每隔5 h取样一次,每批取样6个,共取样6个批次、35个样品。用前四批样品建立校正集模型,余下两批样品作为验证集。分别采用透射模式和漫反射模式对离心破碎后的发酵上清液和发酵液原液建立GSH含量检测的近红外分析模型。采用HPLC方法测定发酵液中GSH的含量作为参考值,通过光谱预处理方法探索和波段的选择得到的两种近红外分析模型的最佳预处理方法分别为一阶导数FD-SG(7,2)平滑和二阶导数-Norris(51,5)平滑,校正集相关系数Rc、交叉验证相关系数Rcv、验证集相关系数Rp、校正集误差均方根RMSEC、交叉验证误差均方根RMSECV、验证集误差均方根 RMSEP 分别为 0.9957、0.9787、0.9372、0.0497 g/L、0.111 g/L、0.119 g/L和 0.9464、0.9110、0.9082、0.166 g/L、0.212 g/L、0.279 g/L。初步的可行性实验研究表明,NIRS有望取代HPLC用于GSH发酵终点含量的快速检测。目前用于菌体破碎后产品含量检测的结果优于发酵液直接测定的结果,在后续的实际工作中,还需要进一步对采样附件、采样条件等进行优化。(2)NIRS用于GSH产品水分含量的快速检测研究本研究应用近红外漫反射光谱进行了 GSH原料药中水分含量快速检测模型的建立和性能评价。在实验室条件下利用冻干的方法制备了 6批共44份不同水分含量的GSH样品并采集NIRS,通过KS分类法选出29份校正集样品,15份验证集样品,采用红外水分快速分析法测定的GSH样品含水量作为参考值,选择FD-SG(13,2)平滑-Autoscale预处理方法和全波段光谱,建立起GSH样品中水分含量检测的NIRS最优模型,其Rc、Rcv、Rp、RMSEC、RMSECV、RMSEP值分别为 0.9798、0.9638、0.9072、0.1113%、0.1490%、0.1254%。评价结果显示,模型有较好的预测能力,可用于GSH产品中水分含量的快速检测。(3)NIRS用于GSH产品中GSSG含量快速检测研究本研究应用NIR-DRS进行了 GSH原料药中GSSG含量快速检测模型的建立和性能评价。在实验室条件下按固定配比制备33份不同GSSG含量的GSH样品并采集NIRS,按梯度分类法将样品划分为23个校正集样品和10个验证集样品,选择FD-SG(15,2)平滑-Autoscale预处理方法和iPLS间隔为30的波段选择方法,建立起GSH样品中GSSG含量检测的NIRS最优模型,其Rc、Rcv、Rp、RMSEC、RMSECV、RMSEP 值分别为 0.9958、0.9734、0.9333、0.0459%、0.1192%、0.1832%。评价结果显示模型有较好的预测能力,可用于GSH产品中GSSG含量的快速检测。本论文的创新点包括:(1)本研究首次将NIRS用于生产发酵过程中GSH浓度的快速无损分析并有望取代HPLC进行终点浓度检测。(2)首次提出利用NIRS实现生产发酵过程中GSH含量变化的在线实时监测以进行及时干预这一思路。(3)首次将NIRS用于GSH发酵产品中水分和GSSG等关键质量属性的快速无损检测,实现了 GSH产品的快速质量控制。(4)模型的建立过程中对多种模型优化方法进行了深入探讨和研究,提供了复杂体系下建立模型的参考依据。