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本论文选择尖顶羊肚菌为实验材料,以深层发酵获取尖顶羊肚菌胞外多糖提取物,通过体外抗氧化实验、果蝇寿命实验和小鼠生理、生化实验来探究其抗衰老功效,并制成了功能性健康食品-尖顶羊肚菌胞外多糖颗粒和胶囊制剂,发现这两种食品具有良好的延缓衰老作用。具体实验方法及结果如下:
1.尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备:采用化学合成培养基从液体培养发酵尖顶羊肚菌两种不同菌株(尖顶羊肚菌M-2和尖顶羊肚菌M-1),将发酵液浓缩、去蛋白、乙醇沉淀、真空冷冻干燥,获得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物MCEE-1和MCEE-2。
2.体外抗氧化实验:以Vc为阳性对照,并对尖顶羊肚菌抑制ABTS自由基、对羟基自由基以及对超氧阴离子的作用进行实验,根据实验数据评价其体外抗氧化活性。结果表明:抑制不同种自由基所需的多糖浓度有差别。2mg/mL的MCEE-1和MCEE-2对超氧阴离子的抑制率分别为45.81%、43.06%;1mg/mL的MCEE-1和MCEE-2对羟基自由基的抑制率分别为60.98%、72.4%;0.1mg/mL的MCEE-1和MCEE-2对ABTS自由基的抑制率可达58.79%、77.43%。尖顶羊肚菌胞外多糖对·OH和O2-·和ABTS+自由基均具有抑制作用,而且成一定的量效关系,总体效果是Vc的抑制作用最强,MCEE-2比MCEE-1的抑制作用稍强。
3.果蝇寿命实验:用剂量分别为0.2g/L、1g/L、5g/L和25g/L的胞外多糖提取物作为果蝇的饲料添加物,其中复合多糖中单糖的比例为1:1即MCEE-1:MCEE-2以1:1的比例混合。结果表明:尖顶羊肚菌胞外多糖提取物可明显延长果蝇的寿命。0.2g/L的MCEE-1可使雌、雄果蝇的寿命分别延长13.45%和24.58%,使雌雄果蝇的最高寿命分别延长了20.87%和34.07%,但随着浓度的升高会不同程度地缩短果蝇的寿命。0.2g/L的MCEE-2能显著延长雌雄果蝇的平均寿命、半数死亡时间和最高寿命(P<0.01),起到较好的延缓衰老作用。0.2g/L的复合多糖能使雄性果蝇的平均寿命、半数死亡时间和最高寿命都延长,但不存在显著性差异。这提示MCEE-2比MCEE-1的延寿效果好,经实验筛选后以MCEE-2做小鼠生理试验。此外,雌雄果蝇对尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的反应存在性别差异,对雄性果蝇延寿效果比对雌性果蝇的好。
4.小鼠生理生化实验:通过注射D-半乳糖建立小鼠衰老模型,分别用50mg/kg·d、200 mg/kg·d、800mg/kg·d的MCEE-2灌胃衰老模型小鼠,测定小鼠的脏器指标和对小鼠脑组织中的SOD活性,LF含量及MDA含量的影响。结果表明:实验42天后发现,与对照组比较,模型组小鼠出现衰老特征,脑组织中的SOD活性下降、LF含量和MDA含量增加,其肝脏组织出现病变现象,造模比较可靠。三个剂量组的MCEE-2能显著降低衰老小鼠脑组织中的LF含量和MDA含量,但中、高剂量组的MCEE-2对衰老小鼠脑组织中的SOD活性影响效果不大明显,低剂量组的MCEE-2能使雄性、雌性小鼠脑的SOD活性分别提高20.70%、21.13%。这提示MCEE-2具有良好的延缓衰老作用。
5.在以上实验的基础上研制出MCEE-2的功能性健康食品一颗粒冲剂和胶囊制剂,再将此产品进行小鼠延缓衰老实验,颗粒试验组的浓度分别为1962mg/kg·d、654 mg/kg·d;胶囊试验组的浓度分别为165 mg/kg·d、55 mg/kg·d(分别相当于含150mg/kg·d、50mg/kg·d的MCEE-2)。结果表明:此颗粒剂中MCEE-2的含量为3.81%,MCEE-2颗粒剂为乳白色,多糖颗粒的直径约为0.9mm,颗粒大小均匀,在水中溶解性好,溶液澄清透明,无焦屑等杂质,甜味适中;此胶囊中MCEE-2含量为45.32%,MCEE-2胶囊内充物为淡黄色,选用0号胶囊,装量为0.265g,少量不溶于水。小鼠生理实验表明:尖顶羊肚菌胞外多糖颗粒和尖顶羊肚菌胞外多糖胶囊对雄性衰老小鼠血清中的SOD和GSH-Px活力的增加效果较为明显,降低雌性脑组织中MDA含量的较为明显。其中,654 mg/kg·d的颗粒冲剂使雄性小鼠血清中的SOD、GSH-Px含量分别提高了60.71%(P<0.01)和66.62%(P<0.01),使雌性衰老小鼠脑组织中的MDA含量降低了32.67%(P<0.01);165mg/kg·d和55mg/kg·d的多糖胶囊可显著增加雄性小鼠血清中的SOD、GSH-Px含量(P<0.01),使雌性衰老小鼠脑组织中的MDA含量分别降低了27.58%(P<0.01)和34.29%(P<0.01)。
结论:一定浓度的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物具有良好的抗氧化和延缓衰老的作用。