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目的：
类风湿性关节炎是一种慢性全身性自身免疫性综合症，目前全球约有1%的人口患病。目前针对类风湿关节炎的治疗主要以对症治疗为主，而不能阻止RA病情的发展和患者的残疾。我们前期研究表明，针对滑膜血管翳的治疗方法可以起到阻断RA发展的作用。因此积极寻找导致滑膜血管增生和病变的原因，阐明滑膜血管翳的形成机制，寻找有效的干预靶点以提供有效的干预手段，是类风湿性关节炎治疗的关键。
类风湿性关节炎中关节腔酸化是疾病的主要特征之一，这是由于 RA滑膜炎症区域组织缺血缺氧，导致耗氧量增加，糖酵解增加，从而引起乳酸堆积，因此RA患者的关节腔内PH值常降低至6.0以下。已有研究表明，PH较低的细胞外环境与 RA患者滑膜组织血管翳的形成具有相关性。但是这种酸性信号是如何传导到细胞内，又如何介导了血管翳的形成呢？酸敏感离子通道（ASICs）是一类由细胞外环境酸化所激活的阳离子通道，属于上皮钠通道家族的一员，其中ASIC1a在胞外酸化刺激时，可同时介导NA+和Ca2+内流，进而将细胞外低PH值信号传导到细胞内。已有研究发现，ASIC1a能够紧密的参与到RA的发展过程中，那么RA中细胞外酸环境是否可以通过激活ASIC1a，进而将细胞外低PH值信号传导进细胞内，进一步介导了滑膜血管翳的形成呢？因此，本课题组设计以下实验探究RA中细胞外酸环境是否可以通过激活ASIC1a调控血管翳的形成及其机制。
方法：
1.观察酸敏感离子通道1a在正常人滑膜和类风湿性关节炎病人滑膜中的表达差异。
免疫组化法观察 ASIC1a在正常人滑膜组织组织和类风湿性关节炎病人滑膜组织中的表达。收取由于事故导致截肢后的患者膝滑膜组织（n=3）和滑膜切除术以及关节置换术患者滑膜组织（n=42），使用免疫组化法探究ASIC1a在两种组织中的表达差异。使用贴壁法提取正常人原代滑膜成纤维细胞（NSF，n=1）和类风湿性关节炎患者原代滑膜成纤维细胞（RASF，n=3），使用流式细胞术探究NSF和RASF细胞表面膜抗原CD55以及膜蛋白ASIC1a的表达差异。提取NSF和RASF总蛋白，使用Western blotting检测总蛋白中ASICs家组蛋白的表达差异。提取NSF和RASF膜蛋白，使用Western blotting探究二者膜蛋白ASIC1a表达差异，使用免疫荧光法检测未破膜处理的NSF和RASF的ASIC1a表达差异。
2.探究酸刺激是否可以通ASIC1a促进滑膜成纤维细胞释放VEGF。
使用ELISA法探究不同处理下RASF对VEGF的合成及释放能力。设计酸刺激的时间梯度（0h,45min,1.5h,3h.6h）使用Western blotting和免疫荧光法检测刺激不同时间后 RASF细胞中 VEGF的表达水平。使用 ELISA法检测无酸刺激和酸刺激0h,3h,6h,12h,24h后培养基中 VEGF的浓度。构建 ASIC1a沉默细胞株以及使用ASIC1a特异性抑制剂PcTx-1预处理RASF，使用ELISA法检测无酸刺激以及酸刺激0h,12h,24h后培养基中VEGF的浓度。构建ASIC1a过表达细胞株，使用ELISA法检测无酸刺激以及酸刺激0h,12h,24h后培养基中VEGF的浓度。
3.探究ASIC1a对VEGF的调节过程是否参与了关节炎中血管翳的形成。
构建佐剂性关节炎大鼠（AA大鼠）模型，于造模成功后关节腔注射ASIC1a特异性抑制剂PcTx-1，观察给药前后AA大鼠关节腔病理改变。使用HE染色法观察正常人滑膜组织和类风湿性关节炎病人滑膜组织的病理改变，采用免疫组化法探究正常人和类风湿性关节炎病人滑膜组织中 VEGF和由 CD34标记的微血管密度的改变。构建AA大鼠模型，将AA大鼠分为对照组，模型组，PcTx-10.5μg/kg组，PcTx-11μg/kg组，PcTx-12μg/kg组和曲安奈德（TA）组，使用HE染色法观察造模前后 AA大鼠关节腔病理改变，免疫组化法观察 AA大鼠关节腔中微血管密度变化。使用PcTx-1和TA每两天给药一次，持续26天，使用HE染色技术观察给药结束后AA大鼠关节腔病理改变，使用免疫组化法观察给药结束后AA大鼠关节腔中ASIC1a，VEGF和由CD34标记的微血管密度改变。使
结果：
1.ASIC1a在类风湿性关节病人的滑膜组织中表达显著升高，在ASICs家族蛋白中ASIC1a和ASIC3在RASF中表达显著升高，而ASIC1a的膜蛋白在类风湿性关节炎中表达升高，以上结果说明ASIC1a在类风湿性关节炎中表达水平和对细胞膜的转移均得到增强，说明ASIC1a可能参与了类风湿性关节炎疾病的发展。
2.酸刺激可以通过ASIC1a促进滑膜成纤维细胞释放VEGF。使用酸刺激不同时间后，滑膜成纤维细胞中VEGF的表达以及培养基中VEGF的浓度均上升，并且细胞中VEGF的表达水平在3h达到最高，随后略有降低，而培养基中的VEGF表达水平升高具有时间依赖性。免疫荧光结果与Western blotting结果一致，这说明滑膜成纤维细胞中 VEGF的表达可能经历了从合成到释放的过程。将 ASIC1a沉默或阻断后，均可以显著减少酸刺激下细胞对VEGF的释放。而ASIC1a过表达后，滑膜成纤维细胞在酸刺激下对VEGF的释放水平增加。
3.ASIC1a对VEGF的调控过程可能参与了关节炎中血管翳的发展。在对人滑膜组织的病理学检验中发现，相比于正常人，类风湿性关节炎患者的滑膜组织存在明显的增生，炎性浸润和血管翳。免疫组化结果显示，类风湿性关节炎患者滑膜组织中VEGF表达水平和由CD34标记的微血管密度显升高。对AA大鼠的病理学检验中发现，AA大鼠关节腔出现明显的炎症和软骨损伤，微血管密度升高。
使用ASIC1a特异性抑制剂PcTx-1处理后，AA大鼠关节炎症明显减轻，软骨损伤降低，不同剂量的PcTx-1均降低了关节腔中ASIC1a的表达。免疫组化结果显示， AA大鼠关节腔中VEGF的表达水平和微血管密度均随PcTx-1浓度依赖性降低。免疫荧光结果显示，和正常组大鼠相比，AA大鼠滑膜微血管出现明显的血管新生，血管壁由单层变为多层，而不同剂量的PcTx-1均可以减少AA大鼠关节腔中微血管的病变。
结论：
1.在类风湿性关节炎中，酸可以通过ASIC1a促进RASF释放VEGF。
2.在类风湿性关节炎中，ASIC1a对VEGF的调控过程可能参与了滑膜血管翳的发展。
类风湿性关节炎是一种慢性全身性自身免疫性综合症，目前全球约有1%的人口患病。目前针对类风湿关节炎的治疗主要以对症治疗为主，而不能阻止RA病情的发展和患者的残疾。我们前期研究表明，针对滑膜血管翳的治疗方法可以起到阻断RA发展的作用。因此积极寻找导致滑膜血管增生和病变的原因，阐明滑膜血管翳的形成机制，寻找有效的干预靶点以提供有效的干预手段，是类风湿性关节炎治疗的关键。
类风湿性关节炎中关节腔酸化是疾病的主要特征之一，这是由于 RA滑膜炎症区域组织缺血缺氧，导致耗氧量增加，糖酵解增加，从而引起乳酸堆积，因此RA患者的关节腔内PH值常降低至6.0以下。已有研究表明，PH较低的细胞外环境与 RA患者滑膜组织血管翳的形成具有相关性。但是这种酸性信号是如何传导到细胞内，又如何介导了血管翳的形成呢？酸敏感离子通道（ASICs）是一类由细胞外环境酸化所激活的阳离子通道，属于上皮钠通道家族的一员，其中ASIC1a在胞外酸化刺激时，可同时介导NA+和Ca2+内流，进而将细胞外低PH值信号传导到细胞内。已有研究发现，ASIC1a能够紧密的参与到RA的发展过程中，那么RA中细胞外酸环境是否可以通过激活ASIC1a，进而将细胞外低PH值信号传导进细胞内，进一步介导了滑膜血管翳的形成呢？因此，本课题组设计以下实验探究RA中细胞外酸环境是否可以通过激活ASIC1a调控血管翳的形成及其机制。
方法：
1.观察酸敏感离子通道1a在正常人滑膜和类风湿性关节炎病人滑膜中的表达差异。
免疫组化法观察 ASIC1a在正常人滑膜组织组织和类风湿性关节炎病人滑膜组织中的表达。收取由于事故导致截肢后的患者膝滑膜组织（n=3）和滑膜切除术以及关节置换术患者滑膜组织（n=42），使用免疫组化法探究ASIC1a在两种组织中的表达差异。使用贴壁法提取正常人原代滑膜成纤维细胞（NSF，n=1）和类风湿性关节炎患者原代滑膜成纤维细胞（RASF，n=3），使用流式细胞术探究NSF和RASF细胞表面膜抗原CD55以及膜蛋白ASIC1a的表达差异。提取NSF和RASF总蛋白，使用Western blotting检测总蛋白中ASICs家组蛋白的表达差异。提取NSF和RASF膜蛋白，使用Western blotting探究二者膜蛋白ASIC1a表达差异，使用免疫荧光法检测未破膜处理的NSF和RASF的ASIC1a表达差异。
2.探究酸刺激是否可以通ASIC1a促进滑膜成纤维细胞释放VEGF。
使用ELISA法探究不同处理下RASF对VEGF的合成及释放能力。设计酸刺激的时间梯度（0h,45min,1.5h,3h.6h）使用Western blotting和免疫荧光法检测刺激不同时间后 RASF细胞中 VEGF的表达水平。使用 ELISA法检测无酸刺激和酸刺激0h,3h,6h,12h,24h后培养基中 VEGF的浓度。构建 ASIC1a沉默细胞株以及使用ASIC1a特异性抑制剂PcTx-1预处理RASF，使用ELISA法检测无酸刺激以及酸刺激0h,12h,24h后培养基中VEGF的浓度。构建ASIC1a过表达细胞株，使用ELISA法检测无酸刺激以及酸刺激0h,12h,24h后培养基中VEGF的浓度。
3.探究ASIC1a对VEGF的调节过程是否参与了关节炎中血管翳的形成。
构建佐剂性关节炎大鼠（AA大鼠）模型，于造模成功后关节腔注射ASIC1a特异性抑制剂PcTx-1，观察给药前后AA大鼠关节腔病理改变。使用HE染色法观察正常人滑膜组织和类风湿性关节炎病人滑膜组织的病理改变，采用免疫组化法探究正常人和类风湿性关节炎病人滑膜组织中 VEGF和由 CD34标记的微血管密度的改变。构建AA大鼠模型，将AA大鼠分为对照组，模型组，PcTx-10.5μg/kg组，PcTx-11μg/kg组，PcTx-12μg/kg组和曲安奈德（TA）组，使用HE染色法观察造模前后 AA大鼠关节腔病理改变，免疫组化法观察 AA大鼠关节腔中微血管密度变化。使用PcTx-1和TA每两天给药一次，持续26天，使用HE染色技术观察给药结束后AA大鼠关节腔病理改变，使用免疫组化法观察给药结束后AA大鼠关节腔中ASIC1a，VEGF和由CD34标记的微血管密度改变。使
结果：
1.ASIC1a在类风湿性关节病人的滑膜组织中表达显著升高，在ASICs家族蛋白中ASIC1a和ASIC3在RASF中表达显著升高，而ASIC1a的膜蛋白在类风湿性关节炎中表达升高，以上结果说明ASIC1a在类风湿性关节炎中表达水平和对细胞膜的转移均得到增强，说明ASIC1a可能参与了类风湿性关节炎疾病的发展。
2.酸刺激可以通过ASIC1a促进滑膜成纤维细胞释放VEGF。使用酸刺激不同时间后，滑膜成纤维细胞中VEGF的表达以及培养基中VEGF的浓度均上升，并且细胞中VEGF的表达水平在3h达到最高，随后略有降低，而培养基中的VEGF表达水平升高具有时间依赖性。免疫荧光结果与Western blotting结果一致，这说明滑膜成纤维细胞中 VEGF的表达可能经历了从合成到释放的过程。将 ASIC1a沉默或阻断后，均可以显著减少酸刺激下细胞对VEGF的释放。而ASIC1a过表达后，滑膜成纤维细胞在酸刺激下对VEGF的释放水平增加。
3.ASIC1a对VEGF的调控过程可能参与了关节炎中血管翳的发展。在对人滑膜组织的病理学检验中发现，相比于正常人，类风湿性关节炎患者的滑膜组织存在明显的增生，炎性浸润和血管翳。免疫组化结果显示，类风湿性关节炎患者滑膜组织中VEGF表达水平和由CD34标记的微血管密度显升高。对AA大鼠的病理学检验中发现，AA大鼠关节腔出现明显的炎症和软骨损伤，微血管密度升高。
使用ASIC1a特异性抑制剂PcTx-1处理后，AA大鼠关节炎症明显减轻，软骨损伤降低，不同剂量的PcTx-1均降低了关节腔中ASIC1a的表达。免疫组化结果显示， AA大鼠关节腔中VEGF的表达水平和微血管密度均随PcTx-1浓度依赖性降低。免疫荧光结果显示，和正常组大鼠相比，AA大鼠滑膜微血管出现明显的血管新生，血管壁由单层变为多层，而不同剂量的PcTx-1均可以减少AA大鼠关节腔中微血管的病变。
结论：
1.在类风湿性关节炎中，酸可以通过ASIC1a促进RASF释放VEGF。
2.在类风湿性关节炎中，ASIC1a对VEGF的调控过程可能参与了滑膜血管翳的发展。