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背景:我国是肝癌高发地区,约占全球肝癌的40%,明确肝癌发病机制和寻找有效靶点至关重要。我们在查找Cristrome Data Browser chip-seq数据库时发现,miR-5188在肝细胞癌中可能受Wnt/β-catenin通路下游信号分子c-Jun的调控,同时,生物信息学软件预测发现抑癌基因FOXO1可能是miR-5188的靶基因。作为一个近年新发现的microRNA,miR-5188在肝癌中具体功能,以及它和Wnt/β-catenin通路、FOXO1之间的关系值得我们去深入研究。目的:1.探讨miR-5188对肝癌侵袭迁移、干细胞特性、化疗耐药的影响;2.探讨miR-5188在肝癌中发挥功能的具体机制;3.明确miR-5188的靶基因和miR-5188如何调控靶基因;4.分析miR-5188和靶基因在肝癌组织中的表达特性及相关关系。方法:1.体外功能实验研究miR-5188在肝癌细胞中的功能(1)构建过表达miR-5188的肝癌细胞株Hep3B、Huh7和干扰miR-5188的肝癌细胞株 HCCLM3、PLC/PRF/5;(2)划痕实验、Transwell迁移、Boyden侵袭实验验证miR-5188对细胞侵袭迁移的影响;(3)肿瘤成球实验、流式细胞术、裸鼠皮下成瘤模型和裸鼠肝包膜肺转移模型验证miR-5188对肿瘤干性的影响;(4)MTT药敏实验验证miR-5188对化疗效果的影响。2.miR-5188影响肝癌细胞生物学功能的具体机制(1)Western Blot检测过表达miR-5188后Wnt/β-catenin通路相关蛋白、肿瘤干性相关蛋白、EMT相关蛋白、化疗耐药相关蛋白表达的改变;(2)在过表达miR-5188的肝癌细胞中用si-β-catenin下调Wnt信号通路后,观察细胞生物学行为的改变。3.Wnt/β-catenin下游分子c-Jun与miR-5188的相关关系(1)生物信息学软件预测c-Jun与miR-5188启动子区域的结合位点;(2)凝胶电泳迁移率实验、染色质共沉淀技术、双荧光素酶报告实验验证c-Jun与miR-5188启动子区的关系;(3)si-c-Jun下调c-Jun表达后,荧光定量PCR检测miR-5188表达水平的变化。4.miR-5188靶基因的验证(1)生物信息学预测miR-5188与靶基因FOXO1的结合位点;(2)双荧光素酶报告实验验证FOXO1是miR-5188的靶基因;(3)Western Blot和荧光定量PCR检测过表达miR-5188后FOXO1蛋白和mRNA的改变;(4)在过表达miR-5188的肝癌细胞中转染FOXO1质粒或在干扰miR-5188的细胞中转染si-FOXO1质粒,检测细胞生物学行为以及Wnt/β-catenin通路蛋白的改变。5.探讨FOXO1与β-catenin的相关关系免疫共沉淀、激光共聚焦验证FOXO1是否可结合β-catenin。6.miR-5188、FOXO1在肝癌组织中的表达特性和相关关系原位杂交观察miR-5188在肝癌组织和癌旁组织中的表达差异,分析其表达水平与临床参数、预后的关系;分析miR-5188与FOXO1的相关性。结果:1.miR-5188促进肝癌侵袭迁移、增强干细胞特性和诱导化疗耐药;2.miR-5188激活Wnt/β-catenin及其下游信号通路发挥作用;3.Wnt/β-catenin 下游信号分子 c-Jun 促进 miR-5188 转录,miR-5188、Wnt/β-catenin、c-Jun三者形成互相激活的环路;4.miR-5188靶向抑制FOXO1的蛋白表达,FOXO1可以逆转miR-5188对Wnt/β-catenin通路的激活作用;5.FOX01可与Wnt/β-catenin通路关键信号分子β-catenin结合;6.miR-5188高表达是肝癌患者不良的预后因素,肝癌组织中miR-5188的表达与FOXO1负相关。结论:miR-5188在肝癌中发挥促癌基因的作用,它通过靶向抑制FOXO1蛋白表达,上调Wnt/β-catenin信号通路,促进肝癌细胞的侵袭迁移、干性和化疗耐药。此外,Wnt/β-catenin下游信号分子c-Jun还能结合miR-5188启动子,促进miR-5188表达,形成miR-5188/Wnt/c-Jun互相激活环路。如下图所示: