论文部分内容阅读
肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是一组常见的慢性肝疾病的临床表现和病理学综合征。在整个肝纤维化发生发展的过程中，肝脏细胞内许多基因发生异常表达，并伴有发展为肝细胞癌的危险性增加。在肝组织发生纤维化过程中，肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）的活化增殖可谓是一个重要环节，而NF-κB (nuclear factor kappa B)及其调控系统又是介导炎症反应的关键调节因子。活化的HSCs内NF-κB活性增强，导致炎性因子表达增加，放大肝脏炎症损伤反应，进一步促进了HSCs的活化；与此同时，NF-κB活性增强还可抑制HSCs凋亡。SUMO-1基因是小泛素相关修饰物（SUMO，small ubipuitin-like modifier）基因家族中的一员，SUMO-1通过共价连接修饰靶蛋白,并参与蛋白质间的相互作用，调控细胞内靶蛋白分布及其功能。近年来的研究显示，SUMO参与了NF-κB信号通路的调节，该通路中重要的蛋白因子如IκBα、NEMO均可被SUMO化修饰；并且SUMO化修饰酶还可通过作为构架蛋白与一些蛋白直接相互作用从而调控NF-κB信号通路。因此，如能探究SUMO-1在肝纤维化进展过程中的作用及其在NF-κB信号通路的调控作用，那么通过抑制SUMO-1对NF-κB信号通路的修饰激活将对减少HSCs活化，促进HSCs凋亡等将有着极为重要的意义，也可能对肝纤维化乃至肝癌的治疗策略将产生积极影响。第一部分肝纤维化模型大鼠肝脏中SUMO-1及P65的表达变化目的：探讨肝纤维化模型大鼠肝脏中SUMO-1及P65的表达情况方法：将40只SD大鼠进行随机分组，造模组(n=22)和对照组(n=18)；造模组给予40%CCl43μL/g四肢皮下注射，每周两次，在同时间点对照组予同等量生理盐水四肢皮下注射；于造模后4、8、12周末断颈处死大鼠，每次处死大鼠造模组(n=6)和对照组(n=4)，留取肝组织；造模期间观察大鼠一般情况。采用苏木精-伊红染色（HE染色）观察各组大鼠肝组织病理改变，免疫组化对SUMO-1表达进行定位及观察其相对量的变化，Real time-PCR检测SUMO-1mRNA的表达，Western blot检测SUMO-1及p65蛋白水平。结果：随着造模周期的延长，HE染色可见大鼠肝细胞变性至肝纤维化的形成，免疫组化可见SUMO-1在肝纤维化大鼠模型肝脏中表达且随着时间推移表达趋势逐渐增强。Real time-PCR显示SUMO-1mRNA表达逐渐增强，各组差异具有统计学意义（P<0.05）。Western blot验证SUMO-1、p65表达逐渐增强，各组间差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：随着大鼠肝纤维化的形成SUMO-1及p65表达逐渐增高，二者可能在肝纤维变化过程中有重要作用，同时NF-κB信号通路活性的变化可能和SUMO-1的表达水平有关。第二部分SUMO-1在大鼠肝纤维化相关NF-κB信号通路中的调控作用目的：初步探讨SUMO-1在NF-κB信号通路的调控作用方法：将人工合成的针对SUMO-1基因的siRNA慢病毒、SUMO-1过表达慢病毒载体转染肝星状细胞，采用Real time-PCR、Western blot方法检测转染后肝星状细胞中SUMO-1的表达状况，并采用Western blot方法检测转染各载体后肝星状细胞后P65在蛋白水平的变化。结果：人工合成的针对SUMO-1基因的siRNA慢病毒能抑制肝星状细胞中SUMO-1基因的表达，而SUMO-1过表达慢病毒载体转染肝星状细胞后SUMO-1表达增强。Western blot验证体外培养的肝星状细胞转染SUMO-1siRNA后p65表达下调，转染SUMO-1过表达慢病毒载体后p65表达上升。结论：SUMO-1siRNA沉默肝星状细胞中SUMO-1基因效果良好，SUMO-1基因沉默后P65表达下调，而SUMO-1过表达时p65表达上升，二者表达正相关，说明SUMO-1可能通过修饰p65而调控NF-κB信号通路，进而参与肝纤维化发生发展。