研究背景和目的Hint2（Histidine triad nucleotide bingding protein 2）,即三联组氨酸结合蛋白2,是HIT（histidine triad protein）超家族中Hint家族组的成员之一。HIT超家族蛋白质具有相同基本结构域His-X-His-X-His-X-X,其中His为组氨酸,X是一种疏水氨基酸。HIT蛋白普遍存在于原核生物和真核生物中。到目前为止已经在29个物种中鉴定出来35个HIT超家族的成员,这些物种包括细菌,古细菌,酵母菌,植物,C形线虫,果蝇和哺乳动物。HIT蛋白在经过了生物的不断进化后被保留下来,这意味着它们具有最基本的,也可能是重要的生理功能^[1]。人类Hint2是一种与Hint1有61%相似度的蛋白,并且其在肝脏肿瘤中的表达水平明显低于周围正常肝组织^[2]。已经有文献证实Hint1能影响与肿瘤形成的信号通路以及细胞周期^[3-15]。另一方面,Hint2蛋白定位于线粒体,而线粒体调节凋亡信号级联反应,这也是外源性和内源性信号通过对死亡受体的激活破坏细胞内稳态的开关。前期的实验已经初步证实Hint2在结直肠癌组织中的表达水平低于周围正常粘膜组织。因此猜想与Hint1具有高度同源性的Hint2可能对结直肠癌细胞的生长和凋亡有影响。而增殖和凋亡是肿瘤细胞具有侵袭和迁移能力的重要基础。目前还没有关于Hint2表达和结直肠癌侵袭、迁移之间关系的文献报道。为此设计此实验以探索Hint2的表达对结直肠癌细胞侵袭、迁移能力的影响。方法1.培养5种常见的结直肠癌细胞系（Caco-2,HT-29,HCT-116,SW480,SW620）,应用实时荧光定量PCR测定Hint2 m RNA水平,应用Wsetern-blot测定hint2蛋白表达水平,并从中挑选出hint2表达水平相对较高的细胞系;2.选择Hint2表达水平相对较高的细胞系SW480,用慢病毒感染的方法以含有shRNA-HINT2序列的慢病毒感染SW480沉默HINT2基因,使该细胞的hint2表达水平下调,并以无效干扰序列sh RNA-Cont感染SW480细胞作为对照组;3.通过嘌呤霉素筛选获得Hint2低表达的SW480^shRNA-hint2稳转细胞株,用Western-blot检测稳转细胞株SW480^shRNA-hint2和对照组SW480^shRNA-cont细胞株hint2蛋白的表达水平。4.通过Transwell小室侵袭、迁移实验和划痕实验比较SW480^{sh RNA-hint2}和SW480^{sh RNA-cont}细胞侵袭、迁移能力的差别。结果1.实时荧光定量PCR检测5株结直肠癌细胞中Hint2 m RNA的相对表达水平结果显示hint2 m RNA水平在SW620中最低,以SW620作为参照,其他组细胞相对于SW620的表达水平在HCT116,SW480,HT-29,Caco-2中依次降低,分别为（3.637±0.422）,（3.250±0.422）,（3.149±0.245）,（3.131±0.596）,各组均数分别与SW620比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.Western-blot测定各结直肠癌细胞中Hint2蛋白水平,结果显示hint2蛋白在SW620细胞中的表达要明显低于Caco-2、HT-29、HCT-116、SW480细胞。结合HINT2 m RNA表达情况,选择SW480作为后续实验对象。3.Wsetern-blot检测沉默SW480细胞HINT2后稳转细胞株SW480^{sh RNA-hint2}Hint2蛋白表达水平,以对照组（转染空载体）蛋白条带的灰度值作为参照,实验组SW480^{sh RNA-hint2}细胞hint2蛋白条带的灰度值为0.26,明显低于对照组SW480^{sh RNA-cont}细胞。4.Transwell小室细胞迁移实验检测细胞的迁移能力,在200倍镜下计数每个视野中的细胞数,结果显示实验组SW480^{sh RNA-hint2}明显高于对照组SW480^{sh RNA-cont}（108.33±7.866 vs 38.00±6.841,P<0.01）。5.Transwell小室细胞侵袭实验检测细胞的侵袭能力,在200倍镜下计数每个视野中的细胞数,结果显示实验组SW480^{sh RNA-hint2}明显高于对照组SW480^{sh RNA-cont}（46.32±2.42 vs 18.67±1.86,P<0.01）。6.划痕试验结果显示:实验组SW480^{sh RNA-hint2}24小时后测得的划痕的宽度与0小时时的初始宽度的差值为（59.33±2.08）,对照组SW480^{sh RNA-cont}为（34.33±2.52）,实验组要明显大于对照组（P<0.01）。结论1.Hint2表达水平在不同的结直肠癌细胞系统并不完全一致,Hint2在SW620中的表达水平要明显低于其在HCT116,SW480,HT-29,Caco-2细胞中的表达水平。2.应用sh RNA能够成功沉默SW480细胞HINT2基因。3.在体外实验中,沉默SW480细胞中HINT2基因后,Hint2的蛋白表达水平下调,细胞的侵袭和迁移能力增强。说明Hint2的表达能够抑制结直肠癌细胞株SW480的侵袭、迁移能力,这可能是Hint2在结直肠癌中具有抑瘤作用的原因之一,但是其抑制肿瘤细胞侵袭、迁移能力的具体机制还有待进一步的研究。