背景:创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的发生率位居创伤首位,随着社会经济的发展,其发生率持续升高,是导致患者伤残和死亡的主要原因。伤后血脑屏障受到破坏,以及局部血流变化和损伤因子、氧自由基等因素的共同作用加剧了病情的恶化,导致损伤区域缺血缺氧,颅内压急剧增高,从而诱发脑疝的形成。在TBI的修复过程中,新生血管起着重要的作用,血管再生可以尽快恢复脑组织缺血区域的血供,改善缺氧状态,使濒临死亡的神经元逐渐趋于正常。因此,早期关注损伤后脑血流灌注的变化以及水肿的情况,并及时采取有效治疗,对于预防并发症的发生以和改善预后都有重要的临床意义。血管生成被认为是TBI后的一种反应性保护机制,能够改善脑灌注,避免或减轻神经细胞的继发性损害。外源性的EPCs作为血管内皮细胞的前体细胞,它的主要作用很可能是参与损伤区域血管的生成、促进和产生功能完善的新生血管而进一步促进损伤神经组织的修复过程,极有可能成为TBI治疗的一种细胞干预方法。但是,目前有关EPCs参与TBI后血管构建的机制、EPCs及其参与形成新生血管在损伤区域的变化过程以及对神经轴索修复的影响和作用等问题均未完全阐明,而SPIO标记的EPCs可被MRI示踪,有望用于TBI修复过程中新生血管形成及其对神经组织修复影响的有效活体监测,动态评价TBI的组织修复过程。本实验通过对TBI后血流灌注和相关病理生理学基础的分析,以EPCs对TBI进行早期干预,评价移植的外源性EPCs对TBI后脑血流灌注和致伤区域微血管变化产生的影响,阐明EPCs可能的修复作用和价值,为TBI修复的进一步研究提供实验影像学基础。目的:本研究前期实验通过CT灌注成像与相关病理生理学的分析,探讨TBI后脑血流变化规律和血脑屏障通透性的演变过程,然后选择高灌注期之前移植磁性标记的EPCs,干预TBI的修复过程。同时采用MR成像和CT灌注成像,动态观察细胞归巢和血流灌注的恢复情况,并结合免疫组化来计数微血管密度的高低,进而判断SPIO-EPCs在TBI中的修复效果。材料和方法:1.大鼠创伤性颅脑损伤CT灌注成像及相关病理生理学基础的初步研究此部分实验选用SD成年雄性大鼠,参照Feeney自由落体装置建立大鼠TBI模型,按照伤后神经功能评分,伤情大致控制在2级水平。实验共设置三个组别,分别为正常对照组、假致伤组、TBI致伤组,TBI致伤组又分为2、6、12、24、48、72、120、168h时相组。伤后分别对各组进行CTPI扫描、脑含水量和血脑屏障通透性测定、以及组织病理学观察。CTPI扫描采用64排螺旋CT,并对原始图像进行后处理,计算出感兴趣区的脑血流量(CBF)、脑血容量(CBV)、表面通透性(PS)和平均通过时间(MTT)等参数。选取伤侧大脑的损伤区域及健侧镜像区域为感兴趣区,计算灌注指标的相对值,即伤侧/健侧(尽量减小个体差异及其他原因造成的误差)。脑含水量的测定按照Elliott公式计算,含水量百分比=(湿重-干重)/湿重×100%;脑组织伊文思蓝(EB)含量的检测采用分光光度法,定量评价血脑屏障的功能受损情况。另外,用40g/L多聚甲醛溶液灌注取材,进行HE染色,光镜下观察各时相点的病理改变。最后,对实验数据进行统计学相关分析,判断影像学变化与病理生理改变的相关性。2.磁标记的外源性EPCs对大鼠TBI血流灌注及微血管影响的实验影像学研究利用上述实验得出的TBI后血流变化规律,在选定的低灌注时相点(6h,12h)对TBI大鼠模型移植SPIO-EPCs。此部分实验共设置4个组别,分别为正常对照组、SPIO对照组、TBI致伤组和SPIO-EPCs移植组(SPIO-EPCs组)。移植后,在设定的时间点对其进行MR成像、CT灌注成像、普鲁士蓝染色以及CD31免疫组化染色。MR成像采用T1WI轴位、T2WI冠状位以及轴位,在移植EPCs后2、24、48h进行扫描,主要观察磁性标记的EPCs的影像学分布情况,实现无创性地动态监测移植细胞。CTPI的扫描方法、参数以及后处理技术与实验第一部分相同,分别于伤后72、120、168h扫描观察移植细胞后血流灌注以及通透性的演变过程。普鲁士蓝和免疫组化染色分别观察移植后内皮祖细胞的分布情况以及移植细胞干预后新生血管的数量和密度。结果:1.大鼠创伤性颅脑损伤CT灌注成像及相关病理生理学基础的初步研究正常对照组和假致伤组各项灌注参数的差异无统计学意义,相对灌注值接近于1。PS值在正常情况下定义为0。两组间脑含水量和EB含量的差异均无统计学意义(P>0.05),病理学表现为正常脑组织。TBI致伤组于伤后2h损伤区域血流灌注骤降达最小值,2h~12h内,相对脑血流量(rCBF)和相对脑血容量(rCBV)仍处于低灌注状态,但有所升高。相对平均通过时间(rMTT)延长,表面通透性(PS)增大。随着时间的延长,rCBF、rCBV逐渐升高,直至伤后24h开始逆转,伤侧呈高灌注状态,PS值达最大。48h为高灌注的顶峰期,后逐渐趋于正常。脑含水量于伤后2h开始升高,48h达到高峰期。伤后2h血脑屏障通透性即开始增加,24h达最大值。通过Spearman相关分析可知,rCBF与含水量之间的变化关系呈正相关(相关系数r=0.905,p=0.002),即伤后2h~48h,rCBF越高,含水量越多,48h至观察结束时,rCBF逐渐降低,含水量也越少。rCBV与含水量的关系变化与rCBF类似(r=0.901,p=0.002)。PS与EB含量的变化规律大体一致,对实验数据进行相关分析,证明两者之间存在正相关(r=0.738,p=0.037),伤后24h之前两者同步上升,之后同步下降大致趋于正常水平。2.磁标记的外源性EPCs对大鼠TBI血流灌注及微血管影响的实验影像学研究SPIO对照组于伤后2、24、48h时相点进行MRI扫描,未发现损伤区域出现低信号范围的明显改变,各时相点,创伤区域脑组织普鲁士蓝染色也未发现蓝染的铁磁颗粒分布区,说明SPIO本身不具有向创伤区域聚集的能力。SPIO-EPCs组也于上述时相点进行MR成像,2h时相点创伤区域呈均匀高信号,无明显低信号区域显示,第24h扫描,损伤区域出现点片状低信号,至第48h,致伤区域内低信号面积显著增大,且显示为均匀低信号。普鲁士蓝染色表明蓝染细胞在创伤区域的分布与时间有明显的关系,即随着时间的延长,大致呈一个从创伤区域周边向中央区域聚集的过程。伤后72、120、168h,SPIO-EPCs组的A、B两个亚组在同一时相点的rCBF、rCBV、rMTT和PS值基本无统计学差异,P>0.05,(但72h的rCBV和144h的rMTT两组之间有显著性差异,P<0.05)。重复测量设计方差分析的结果显示,不同时相点SPIO-EPCs A、B亚组与TBI致伤组的rCBF、rCBV、PS比较有显著性差异(P<0.05),而两大组rMTT比较无显著差异(P>0.05)。伤后各时相点的CD31+细胞与微血管数量经统计学分析可知,SPIO-EPCs A、B亚组之间阳性细胞数和微血管计数的差异无统计学意义,P>0.05;两亚组与TBI致伤组之间的差异均具有统计学意义(P<0.05),即SPIO-EPCs组的CD31阳性细胞数和微血管计数均明显高于TBI致伤组。结论:1.通过建立伤情稳定的大鼠TBI致伤模型,分析其CT灌注参数与脑含水量、血脑屏障通透性、病理学的变化以及两者的相关性,得出CT灌注的各项参数能较好地反映大鼠创伤性脑水肿的分型和血脑屏障通透性的演变过程,因此可以作为一种在活体测量脑组织灌注状况和水肿程度的无创性手段;2.SPIO标记的EPCs能归巢至创伤组织,3.0 T MR成像结合普鲁士蓝染色显示,标记的EPCs在创伤组织内的聚集,提示EPCs可能参与创伤组织的修复;3.在特定的时相点,对大鼠TBI模型静脉移植SPIO-EPCs干预其修复过程,结果表明,高灌注期的灌注量明显下降,并且损伤区域的CD31阳性细胞数和微血管数量呈上升趋势,进一步证明了EPCs在创伤修复中的积极作用。