论文部分内容阅读
肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts，CAFs）是肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）中主要的基质细胞之一。CAFs在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用，如促进肿瘤相关血管的生成，发挥免疫抑制的功能，促进Treg的招募，抑制杀伤性CD8+T细胞的招募与趋化等。
目前靶向CAFs的治疗策略主要包括以下几个方面，一是从数量上入手，直接减少或消除CAFs；二是逆转CAFs的功能进一步降低CAFs的促肿瘤活性；三是诱导CAFs正常化或阻断CAFs激活的相关信号通路等。
一些天然小分子对肿瘤的生长有着显著的抑制作用。姜黄素可以抑制多种肿瘤细胞的生长，但是姜黄素对TME中最主要的CAFs的生长及活性是否有影响，目前尚不明确。
本研究主要通过体外实验探讨了姜黄素对前列腺癌相关成纤维细胞（以下简称为CAF）的作用及相关作用机制，发现姜黄素可通过ROS介导的内质网应激进一步诱导CAF细胞凋亡与细胞周期阻滞。
研究目的：
本课题主要研究了姜黄素对CAFs的影响与具体的机制，希望进一步探索姜黄素在肿瘤免疫治疗中的潜在应用以及潜在靶细胞，并进一步提供其内在分子机制的理论基础。
方法：
MTT实验检测姜黄素对CAF、PC-3、NAF以及小鼠脾细胞的增殖活力的影响。
流式细胞仪检测姜黄素对CAF的促凋亡效应、细胞周期阻滞、胞内活性氧（ROS）、线粒体膜电势（ΔΨm）以及T细胞增殖的变化情况。
细胞集落克隆实验检测姜黄素对CAF增殖活性的长期的影响。
Western Blot检测姜黄素处理CAF后Bax、Bcl-2、Bcl-xl、caspase9、caspase8、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、p-p53、cyclinD1等的表达情况。
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）检测ATF4、CHOP、Bim、PUMA、Bax、Bcl-2等的mRNA的表达情况。
Caspase3活性实验检测CAF中caspase3的活性的变化。
结果：
在本课题研究中，发现姜黄素可以选择性抑制CAF的增殖活性。进一步的细胞集落克隆实验结果表明姜黄素对CAF的活力有着长期的抑制效应，即用姜黄素处理后的CAF细胞形成的细胞集落数目更少。接下来的细胞凋亡实验表明姜黄素可显著的诱导CAF的凋亡，并呈现出显著的剂量依赖效应。
Western Blot结果发现姜黄素处理后的CAF的cleaved-caspase3、cleaved-PARP、Bax等蛋白表达水平显著上调，然而Bcl-2则降低；外源性凋亡的标志性蛋白caspase8几乎检测不到，这些结果表明姜黄素对CAF的抑制作用主要是诱导非外源性凋亡引起的。
细胞周期的阻滞也会影响到细胞的凋亡与增殖活性，而细胞周期的结果显示姜黄素可显著的增加CAF处于G2-M期的比例，Western Blot结果显示p-p53的表达水平增加，这表明姜黄素也可能增加p53的磷酸化进一步诱导CAF的细胞周期阻滞，进而引起细胞的凋亡等事件发生。
流式细胞术的结果发现姜黄素处理后CAF的胞内ROS水平显著的上升，Western Blot结果发现p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP等的表达上调，而在使用ROS去除剂NAC预处理后，这些蛋白的表达则不再增加，这些结果表明姜黄素可通过上调CAF胞内的ROS进一步引起内质网应激。
此外，在使用了NAC预处理后，CAF凋亡的比例显著减少，G2-M期的细胞比例也显著下降，细胞集落形成实验也显示NAC预处理后可一定程度上恢复CAF的增殖活性。Western Blot的结果也表明经NAC预处理后，cleaved-PARP、cleaved-caspase3、p-p53的表达水平显著下降，caspase3的活性也明显降低，线粒体膜电势也得到一定的恢复。
这些结果表明姜黄素诱导CAF细胞凋亡和G2-M期阻滞与ROS的上调相关，信号通路上与ROS介导的PERK-eIF2α-ATF4途径的内质网应激有关。
此外，还探索了低浓度的姜黄素对CAF活性的影响，结果发现低浓度的姜黄素对CAF的增殖活性无显著影响，进而用姜黄素处理后的CAF上清培养T细胞，结果发现姜黄素处理后的CAF上清对T细胞的抑制作用减弱。这些结果表明姜黄素可逆转CAF对T细胞的免疫抑制功能。
结论：
本研究主要探索了姜黄素对CAF的影响，结果发现姜黄素可选择性抑制CAF的增殖活性，且对CAF的增殖活性有着长期的抑制作用。此外，姜黄素对CAF的抑制作用主要与姜黄素诱导CAF的非外源性凋亡与G2-M期阻滞相关。通路上与ROS介导的PERK-eIF2α-ATF4途径的内质网应激有关。此外，低浓度的姜黄素可逆转CAF对T细胞的免疫抑制作用。CAF细胞的减少与免疫抑制作用的解除对肿瘤细胞的免疫治疗提供了有利的方向，这也提示了姜黄素在肿瘤治疗中的新应用。
目前靶向CAFs的治疗策略主要包括以下几个方面，一是从数量上入手，直接减少或消除CAFs；二是逆转CAFs的功能进一步降低CAFs的促肿瘤活性；三是诱导CAFs正常化或阻断CAFs激活的相关信号通路等。
一些天然小分子对肿瘤的生长有着显著的抑制作用。姜黄素可以抑制多种肿瘤细胞的生长，但是姜黄素对TME中最主要的CAFs的生长及活性是否有影响，目前尚不明确。
本研究主要通过体外实验探讨了姜黄素对前列腺癌相关成纤维细胞（以下简称为CAF）的作用及相关作用机制，发现姜黄素可通过ROS介导的内质网应激进一步诱导CAF细胞凋亡与细胞周期阻滞。
研究目的：
本课题主要研究了姜黄素对CAFs的影响与具体的机制，希望进一步探索姜黄素在肿瘤免疫治疗中的潜在应用以及潜在靶细胞，并进一步提供其内在分子机制的理论基础。
方法：
MTT实验检测姜黄素对CAF、PC-3、NAF以及小鼠脾细胞的增殖活力的影响。
流式细胞仪检测姜黄素对CAF的促凋亡效应、细胞周期阻滞、胞内活性氧（ROS）、线粒体膜电势（ΔΨm）以及T细胞增殖的变化情况。
细胞集落克隆实验检测姜黄素对CAF增殖活性的长期的影响。
Western Blot检测姜黄素处理CAF后Bax、Bcl-2、Bcl-xl、caspase9、caspase8、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、p-p53、cyclinD1等的表达情况。
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）检测ATF4、CHOP、Bim、PUMA、Bax、Bcl-2等的mRNA的表达情况。
Caspase3活性实验检测CAF中caspase3的活性的变化。
结果：
在本课题研究中，发现姜黄素可以选择性抑制CAF的增殖活性。进一步的细胞集落克隆实验结果表明姜黄素对CAF的活力有着长期的抑制效应，即用姜黄素处理后的CAF细胞形成的细胞集落数目更少。接下来的细胞凋亡实验表明姜黄素可显著的诱导CAF的凋亡，并呈现出显著的剂量依赖效应。
Western Blot结果发现姜黄素处理后的CAF的cleaved-caspase3、cleaved-PARP、Bax等蛋白表达水平显著上调，然而Bcl-2则降低；外源性凋亡的标志性蛋白caspase8几乎检测不到，这些结果表明姜黄素对CAF的抑制作用主要是诱导非外源性凋亡引起的。
细胞周期的阻滞也会影响到细胞的凋亡与增殖活性，而细胞周期的结果显示姜黄素可显著的增加CAF处于G2-M期的比例，Western Blot结果显示p-p53的表达水平增加，这表明姜黄素也可能增加p53的磷酸化进一步诱导CAF的细胞周期阻滞，进而引起细胞的凋亡等事件发生。
流式细胞术的结果发现姜黄素处理后CAF的胞内ROS水平显著的上升，Western Blot结果发现p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP等的表达上调，而在使用ROS去除剂NAC预处理后，这些蛋白的表达则不再增加，这些结果表明姜黄素可通过上调CAF胞内的ROS进一步引起内质网应激。
此外，在使用了NAC预处理后，CAF凋亡的比例显著减少，G2-M期的细胞比例也显著下降，细胞集落形成实验也显示NAC预处理后可一定程度上恢复CAF的增殖活性。Western Blot的结果也表明经NAC预处理后，cleaved-PARP、cleaved-caspase3、p-p53的表达水平显著下降，caspase3的活性也明显降低，线粒体膜电势也得到一定的恢复。
这些结果表明姜黄素诱导CAF细胞凋亡和G2-M期阻滞与ROS的上调相关，信号通路上与ROS介导的PERK-eIF2α-ATF4途径的内质网应激有关。
此外，还探索了低浓度的姜黄素对CAF活性的影响，结果发现低浓度的姜黄素对CAF的增殖活性无显著影响，进而用姜黄素处理后的CAF上清培养T细胞，结果发现姜黄素处理后的CAF上清对T细胞的抑制作用减弱。这些结果表明姜黄素可逆转CAF对T细胞的免疫抑制功能。
结论：
本研究主要探索了姜黄素对CAF的影响，结果发现姜黄素可选择性抑制CAF的增殖活性，且对CAF的增殖活性有着长期的抑制作用。此外，姜黄素对CAF的抑制作用主要与姜黄素诱导CAF的非外源性凋亡与G2-M期阻滞相关。通路上与ROS介导的PERK-eIF2α-ATF4途径的内质网应激有关。此外，低浓度的姜黄素可逆转CAF对T细胞的免疫抑制作用。CAF细胞的减少与免疫抑制作用的解除对肿瘤细胞的免疫治疗提供了有利的方向，这也提示了姜黄素在肿瘤治疗中的新应用。