【摘 要】
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肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种常见的人兽共患的革兰氏阴性病原菌,可以在多种生态环境中生存,主要引起人的呼吸系统疾病,也可以引起尿路感染、菌血症、脑膜炎及院内感染等疾病;在动物引起牛肺炎、牛乳腺炎、水貂肺炎、猪肺炎等。与此同时,抗生素的大量滥用,加速了多重耐药的肺炎克雷伯菌产生,被称为超级细菌NDM-1,甚至导致对该菌的感染到了无药可用的地步,这使得临床治疗举步维艰
【基金项目】
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“国家自然科学基金”（32072824）； 吉林省自然科学基金（20200201120JC）；
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肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种常见的人兽共患的革兰氏阴性病原菌,可以在多种生态环境中生存,主要引起人的呼吸系统疾病,也可以引起尿路感染、菌血症、脑膜炎及院内感染等疾病;在动物引起牛肺炎、牛乳腺炎、水貂肺炎、猪肺炎等。与此同时,抗生素的大量滥用,加速了多重耐药的肺炎克雷伯菌产生,被称为超级细菌NDM-1,甚至导致对该菌的感染到了无药可用的地步,这使得临床治疗举步维艰。噬菌体是能够特异性侵染裂解细菌的病毒,是一种“精准型”、“可增殖”的活体抗菌物质,具有独特的抗菌机制,是对抗耐药菌的天然“生态药物”,在治疗细菌感染特别是耐药性细菌感染上,具有广阔的应用前景。但在噬菌体治疗的过程中,随着细菌-噬菌体之间的博弈,宿主细菌则对噬菌体产生抗性,严重影响疗效。而阐明细菌对噬菌体产生抗性原因和机制,是噬菌体疗法面临的一个科学与实践问题。本研究以肺炎克雷伯菌K7R为宿主菌,在污水中分离到了一株新的噬菌体,根据标准命名法命名为v B＿Kpn S＿ZH01（简称P-K7R）,然后展开了对P-K7R的一系列研究。首先,对P-K7R的一般生物学特性进行了研究,通过扫描电镜确定了P-K7R为长尾噬菌体,利用双层平板法确定了P-K7R的最佳MOI为0.01,一步生长曲线的结果表明该噬菌体的潜伏期为10 min,细胞的爆发量约为169pfu/cell。该噬菌体还表现出良好的稳定性,在温度稳定性试验中,它在4-50℃之间保持良好的活性,在p H值稳定性试验表明它在p H值3-10之间保持良好活性。对该噬菌体的裂解谱测定表明,其裂解谱相对较窄。本研究对P-K7R的核酸类型及噬菌体组进行了测序和分析,发现该噬菌体的核酸类型为双链DNA,通过测序发现噬菌体P-K7R的全基因组长度为52 111bp,G+C含量为49.13%。基因组序列与数据库中其他噬菌体的序列的同源性最高78.33%,预测到了86个开放阅读框,并对开放阅读框的功能进行了注释,发现该噬菌体不含溶原及毒力相关基因。通过遗传学分析,发现与P-K7R亲缘关系较近的为肠杆菌噬菌体。本研究随后诱导了一株抗噬菌体的肺炎克雷伯菌命名为K7R-5P,并对它进行了一系列的鉴定,通过一般生物学特性分析,发现它在显微镜下形态、菌落形态及生长曲线上与K7R并无区别,在全基因组水平上也与K7R没有差异,对K7R和K7R-5P进行了转录组学水平上的比较,检测到K7R与K7R-5P有5个基因在表达量上有显著差异,分别是omp C、omp F、N5、N102、N103,由于差异基因有与细菌和噬菌体吸附相关的吸附受体,所以猜测K7R-5P对P-K7R产生抗性的原因可能与吸附相关,因此进一步测定了两株菌对噬菌体的吸附率,试验结果表明,K7R的吸附效率可以达到80%以上,而K7R-5P的吸附效率不足20%,二者存在显著的吸附差异。最后为了进一步的验证转录水平的变化会直接引起细菌对噬菌体产生抗性,本研究利用q RT-PCR验证了转录组学结果,然后利用过表达质粒PUC18K,构建了过表达菌株,以验证转录水平的恢复是否会使抗性菌恢复敏感性,试验结果表明,当K7R-5P的omp C基因表达量恢复之后,K7R-5P对噬菌体P-K7R的抗性消失。除此之外,通过噬斑试验、空斑实验及吸附效率测定试验结果表明K7R-5P也会恢复到同K7R一样的水平,说明omp C仅通过表达量的改变就可以引起细菌对噬菌体的抗性,证明了omp C在肺炎克雷伯菌与噬菌体吸附上起关键作用。综上,本研究分离得到了一株新的肺炎克雷伯菌噬菌体P-K7R,丰富了该菌的噬菌体库,并诱导了一株抗噬菌体的肺炎克雷伯菌K7R-5P,在体外研究了对该噬菌体产生抗性的机制,为噬菌体治疗的进一步应用奠定了基础。
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