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摘要：目的 评估实验室开展新冠病毒核酸检测结果可靠性方法 对实验室新冠病毒核酸检测各环节影响检测结果准确度的因素进行分析评估。结果 对实验室检测各个环节关键影响因素做好质量控制，实验室仪器设备各项性能指标达到要求。结论 对采样、检测、试剂等做好质量控制，仪器性能优越，实验室开展新冠病毒核酸检测结果准确可靠。
关键词：新型冠状病毒核酸检测影响因素 采样环节 仪器精密度验证 方法最低检测限验证
【中图分类号】R563.1 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）06-042-02
冠状病毒根据血清型和基因组特点分为α、β、γ、δ4个属。它们可以感染人类、哺乳动物、鸟类、蝙蝠等的呼吸系统、胃肠道、肝脏和中枢神经系统。目前，已知能够感染人的冠状病毒有7种，除去我国2003年暴发的（SARS-CoV）冠状病毒和2012年中东暴发的中东呼吸综合征冠状病毒（MERSr-CoV）以外，其余4种感染人的冠状病毒（HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43和HKU1）可诱发轻微的上呼吸道感染，新型冠状病毒SARS-Cov-2是继上述6种外的第7个感染人的β属冠状病毒。SARS-Cov-2可以通过结合各种粘膜细胞上的血管紧张素转化酶受体进入宿主细胞内，与外界相通的气道粘膜、口腔粘膜，以及眼睑，眼结膜均容易暴露感染。
实时荧光RT-PCR核酸检测技术可高效、快速的完成病毒标本的检测，兼具灵敏度高和特异性强的特点，而成为《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》中首推的检测方法。
为应对新冠疫情，铅山县疾病预防控制中心于2020年8月组建了PCR基因扩增实验室，截至2021年2月完成了包括重点人群，重点场所8000余份样本的检测。
以下，本人结合前期已开展的新型冠状病毒核酸检测工作，对可能影响新冠病毒核酸检测结果的各环节影响因素做一分析评价。
一 采样环节
影响检测结果，造成假阴性的因素很多，其中之一为样本环节，国家感染性疾病临床医学研究专家一份实验室研究数据表明，阳性病例发病后0-7天采集的痰液、鼻咽拭子、口咽拭子3种类型的标本中，核酸检测阳性率为60%，随着病程的发展这3种类型标本阳性率有所降低，根据“新型冠状病毒肺炎防控方案（第七版）”中“新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南”采集标本的类型包括：鼻咽拭子、咽拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、粪便标本、肛拭子、血液标本、血清标本等。专家研究表明SARS-CoV主要感染下呼吸道和肺部，，病灶主要位于肺外带近胸膜处，故在标本类型方面肺泡灌洗液、支气管灌洗液、是较好的标本类型，但具创伤性和交叉污染的风险。痰液在各个不同检测时间段阳性率为较高，在操作简便性和安全性优于肺泡灌洗液，但临床患者症状多以干咳、无痰为主。此外，鼻咽拭子优于口咽拭子。
采样过程人为操作不当;样本收集的时间过早或过晚;没有正确的保存、运输和处理样本;技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等原因也是导致样本检测结果出现假阴性的因素。
病毒本身在体外很快就会裂解掉影响后续检测，所以在保存及运输时，就需要加入病毒保存液，目前病毒保存液分为灭活型和非灭活型两种。
对于不同的检测目的，需要使用不同的病毒保存液，目前广泛使用的这两种保存液各有特点。为了满足不同的检测要求，以及不同的病毒检测实验室条件，采用不同的保存液是非常有必要的。
灭活型保存液：主要是核酸提取裂解液改良的病毒裂解型保存液。采样时内含高浓度的胍盐即可高效灭活病毒，能有效阻止操作员二次感染，但是又含有Rnase抑制剂，能保护病毒核酸不被降解，从而使后续能通过NT-PCR进行检测。而且能在常温下保存相对较长的时间，节省了病毒样品保存以及运输的成本。
非灭活型保存液：主要是以运送培养基为基础改良的病毒维持液型保存液。它能够保持病毒在体外的活性以及抗原和核酸的完整性，含有Hanks液基础，庆大霉素，真菌抗生素，BSA （V） ，冷冻保护剂、生物缓冲剂及氨基酸等，保护病毒蛋白质外壳不易分解，较大程度地保持了病毒样本的原始性。这种保存液除了用于核酸提取检测外，还能用于病毒的培养、分离以及抗原的检测等，但是采样后长时间保存需要保持严格低温。
采样环节所使用的病毒保存液是否符合要求也是保证检测结果准确性的重要因素，目前，我中心新冠病毒核酸檢测主要使用的是山东天爱医疗器械有限公司生产的灭活型病毒采样管，当检测出阳性标本需再次采样送上级培养分离时则采用非灭活型保存液。
二 检测环节
（一）核酸提取
病毒核酸在裂解结合缓冲液存在的环境中释放并与磁珠相结合，通过控制磁棒和磁套的运动实现磁珠的收集、释放、转移、进而完成核酸的整个提取过程。核酸提取过程主要包括以下几个步骤：
⑴ 吸附：在样品结合缓冲液中加入磁珠，充分振荡混合，释放出来的核酸吸附到磁珠表面。
⑵ 洗涤：将上述磁珠收集并转移到洗涤缓冲液中，反复洗涤以除去夹带的杂质。
⑶ 洗脱：把磁珠转移到洗脱缓冲液中，充分振荡混合后，目标核酸即从磁珠表面脱落并溶解到洗脱缓冲液中。
中心使用提取仪为上海之江生物医药科技有限公司生产的全自动磁珠核酸提取仪，型号EX3600型。提取试剂为上海之江生物科技股份有限公司生产。
在此结合日常工作，将此环节应注意的事项总结如下：
1 实验开始前先清洁并消毒工作台面、移液器等;
2 实验操作时使用超净工作台，以防止对环境的污染;
3 操作时使用不含荧光物质的一次性手套，为避免交叉污染，手套必要时及时更换，使用一次性专用离心管、自卸式移液器和带滤嘴的吸头以及提取后应转移至无DNA酶和RNA酶的EP管中等; 4 为避免因试剂成分不均引起的实验结果不稳定，在使用前将试剂充分混匀，另外，预装板使用前应短暂离心或轻甩，将E行液体全部至于孔底部。
（二）PCR扩增检测
采用实时荧光PCR技术，以新型冠状病毒2019-nCoV的RFlab和 N基因设计特异性引物和TaqMan探针，通过荧光定量PCR仪进行扩增，从而实现对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的检测。
该步骤中影响检测结果准确性的关键因素为仪器和检测试剂的性能以及人员操作因素，中心目前使用的PCR扩增仪为美国伯乐CFX96Touch型PCR扩增仪，所使用扩增试剂为新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒（上海伯杰医疗科技有限公司）。
为了保证检测结果的准确性，实验室进行了系列实验，用以对所使用的仪器和检测试剂性能进行验证。
（1）精密度驗证：两个不同浓度的阳性参考品分两组做实验分别为A组，B组，每组做20个平衡样，同时做阴阳对照。分析阳性参考品检出率。统计其2019-nCoVORF1ab基因、N基因、和内参基因Cq值，计算精密度变异系数和阳性样本符合率。
对两组标本的数据进行分析：两组阳性参考品ORF1ab基因、N基因和内参基因的检出率为100%。统计其2019-nCoVORF1ab基因、N基因和内参基因Cq值，计算其精密度变异系数如表二、表三，变异系数均低于3%。说明仪器和试剂精密度性能能够达到检测要求。
（2）最低检测限验证：
检测方法：取中国计量科学研究院的新型冠状病毒核糖核酸基因组标准物质，参照标准物质说明书，对标准物质进行稀释，分别稀释至ORFlab： 500copies/mL>N： 500copies/mL;每个重复检测20次。且阳性检出率达到100%，即可作为预估的最低检测限;
上海伯杰医疗科技有限公司“新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）”在ORFlab基因、N基因浓度为500copies/mL时，用Bio-Rad CFX96检测，20个重复检出率为100%，符合最低检测限要求。
三 结论
综上所述，在检测过程中，对采样、检测、试剂等环节做好质量控制，仪器性能优越，能够保证实验室开展新冠病毒核酸检测结果准确可靠。
参考文献：
[1]中华人民共和国国家卫生健康委员会 新型冠状病毒肺炎防控方案（第七版）
[2]李振昊 高小玲等 新型冠状病毒核酸检测分析[J]《检验医学与临床》 2020 年5月第17卷第10期 1313
[3]丽娟 陈大洋等 新型冠状病毒核酸检测的主要影响因素及控制措施[J]《临床检验杂志》2020年3月38卷第3期223
[4]江西省疾控机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行）
铅山县疾病预防控制中心 江西上饶 334505
关键词：新型冠状病毒核酸检测影响因素 采样环节 仪器精密度验证 方法最低检测限验证
【中图分类号】R563.1 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）06-042-02
冠状病毒根据血清型和基因组特点分为α、β、γ、δ4个属。它们可以感染人类、哺乳动物、鸟类、蝙蝠等的呼吸系统、胃肠道、肝脏和中枢神经系统。目前，已知能够感染人的冠状病毒有7种，除去我国2003年暴发的（SARS-CoV）冠状病毒和2012年中东暴发的中东呼吸综合征冠状病毒（MERSr-CoV）以外，其余4种感染人的冠状病毒（HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43和HKU1）可诱发轻微的上呼吸道感染，新型冠状病毒SARS-Cov-2是继上述6种外的第7个感染人的β属冠状病毒。SARS-Cov-2可以通过结合各种粘膜细胞上的血管紧张素转化酶受体进入宿主细胞内，与外界相通的气道粘膜、口腔粘膜，以及眼睑，眼结膜均容易暴露感染。
实时荧光RT-PCR核酸检测技术可高效、快速的完成病毒标本的检测，兼具灵敏度高和特异性强的特点，而成为《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》中首推的检测方法。
为应对新冠疫情，铅山县疾病预防控制中心于2020年8月组建了PCR基因扩增实验室，截至2021年2月完成了包括重点人群，重点场所8000余份样本的检测。
以下，本人结合前期已开展的新型冠状病毒核酸检测工作，对可能影响新冠病毒核酸检测结果的各环节影响因素做一分析评价。
一 采样环节
影响检测结果，造成假阴性的因素很多，其中之一为样本环节，国家感染性疾病临床医学研究专家一份实验室研究数据表明，阳性病例发病后0-7天采集的痰液、鼻咽拭子、口咽拭子3种类型的标本中，核酸检测阳性率为60%，随着病程的发展这3种类型标本阳性率有所降低，根据“新型冠状病毒肺炎防控方案（第七版）”中“新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南”采集标本的类型包括：鼻咽拭子、咽拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、粪便标本、肛拭子、血液标本、血清标本等。专家研究表明SARS-CoV主要感染下呼吸道和肺部，，病灶主要位于肺外带近胸膜处，故在标本类型方面肺泡灌洗液、支气管灌洗液、是较好的标本类型，但具创伤性和交叉污染的风险。痰液在各个不同检测时间段阳性率为较高，在操作简便性和安全性优于肺泡灌洗液，但临床患者症状多以干咳、无痰为主。此外，鼻咽拭子优于口咽拭子。
采样过程人为操作不当;样本收集的时间过早或过晚;没有正确的保存、运输和处理样本;技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等原因也是导致样本检测结果出现假阴性的因素。
病毒本身在体外很快就会裂解掉影响后续检测，所以在保存及运输时，就需要加入病毒保存液，目前病毒保存液分为灭活型和非灭活型两种。
对于不同的检测目的，需要使用不同的病毒保存液，目前广泛使用的这两种保存液各有特点。为了满足不同的检测要求，以及不同的病毒检测实验室条件，采用不同的保存液是非常有必要的。
灭活型保存液：主要是核酸提取裂解液改良的病毒裂解型保存液。采样时内含高浓度的胍盐即可高效灭活病毒，能有效阻止操作员二次感染，但是又含有Rnase抑制剂，能保护病毒核酸不被降解，从而使后续能通过NT-PCR进行检测。而且能在常温下保存相对较长的时间，节省了病毒样品保存以及运输的成本。
非灭活型保存液：主要是以运送培养基为基础改良的病毒维持液型保存液。它能够保持病毒在体外的活性以及抗原和核酸的完整性，含有Hanks液基础，庆大霉素，真菌抗生素，BSA （V） ，冷冻保护剂、生物缓冲剂及氨基酸等，保护病毒蛋白质外壳不易分解，较大程度地保持了病毒样本的原始性。这种保存液除了用于核酸提取检测外，还能用于病毒的培养、分离以及抗原的检测等，但是采样后长时间保存需要保持严格低温。
采样环节所使用的病毒保存液是否符合要求也是保证检测结果准确性的重要因素，目前，我中心新冠病毒核酸檢测主要使用的是山东天爱医疗器械有限公司生产的灭活型病毒采样管，当检测出阳性标本需再次采样送上级培养分离时则采用非灭活型保存液。
二 检测环节
（一）核酸提取
病毒核酸在裂解结合缓冲液存在的环境中释放并与磁珠相结合，通过控制磁棒和磁套的运动实现磁珠的收集、释放、转移、进而完成核酸的整个提取过程。核酸提取过程主要包括以下几个步骤：
⑴ 吸附：在样品结合缓冲液中加入磁珠，充分振荡混合，释放出来的核酸吸附到磁珠表面。
⑵ 洗涤：将上述磁珠收集并转移到洗涤缓冲液中，反复洗涤以除去夹带的杂质。
⑶ 洗脱：把磁珠转移到洗脱缓冲液中，充分振荡混合后，目标核酸即从磁珠表面脱落并溶解到洗脱缓冲液中。
中心使用提取仪为上海之江生物医药科技有限公司生产的全自动磁珠核酸提取仪，型号EX3600型。提取试剂为上海之江生物科技股份有限公司生产。
在此结合日常工作，将此环节应注意的事项总结如下：
1 实验开始前先清洁并消毒工作台面、移液器等;
2 实验操作时使用超净工作台，以防止对环境的污染;
3 操作时使用不含荧光物质的一次性手套，为避免交叉污染，手套必要时及时更换，使用一次性专用离心管、自卸式移液器和带滤嘴的吸头以及提取后应转移至无DNA酶和RNA酶的EP管中等; 4 为避免因试剂成分不均引起的实验结果不稳定，在使用前将试剂充分混匀，另外，预装板使用前应短暂离心或轻甩，将E行液体全部至于孔底部。
（二）PCR扩增检测
采用实时荧光PCR技术，以新型冠状病毒2019-nCoV的RFlab和 N基因设计特异性引物和TaqMan探针，通过荧光定量PCR仪进行扩增，从而实现对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的检测。
该步骤中影响检测结果准确性的关键因素为仪器和检测试剂的性能以及人员操作因素，中心目前使用的PCR扩增仪为美国伯乐CFX96Touch型PCR扩增仪，所使用扩增试剂为新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒（上海伯杰医疗科技有限公司）。
为了保证检测结果的准确性，实验室进行了系列实验，用以对所使用的仪器和检测试剂性能进行验证。
（1）精密度驗证：两个不同浓度的阳性参考品分两组做实验分别为A组，B组，每组做20个平衡样，同时做阴阳对照。分析阳性参考品检出率。统计其2019-nCoVORF1ab基因、N基因、和内参基因Cq值，计算精密度变异系数和阳性样本符合率。
对两组标本的数据进行分析：两组阳性参考品ORF1ab基因、N基因和内参基因的检出率为100%。统计其2019-nCoVORF1ab基因、N基因和内参基因Cq值，计算其精密度变异系数如表二、表三，变异系数均低于3%。说明仪器和试剂精密度性能能够达到检测要求。
（2）最低检测限验证：
检测方法：取中国计量科学研究院的新型冠状病毒核糖核酸基因组标准物质，参照标准物质说明书，对标准物质进行稀释，分别稀释至ORFlab： 500copies/mL>N： 500copies/mL;每个重复检测20次。且阳性检出率达到100%，即可作为预估的最低检测限;
上海伯杰医疗科技有限公司“新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）”在ORFlab基因、N基因浓度为500copies/mL时，用Bio-Rad CFX96检测，20个重复检出率为100%，符合最低检测限要求。
三 结论
综上所述，在检测过程中，对采样、检测、试剂等环节做好质量控制，仪器性能优越，能够保证实验室开展新冠病毒核酸检测结果准确可靠。
参考文献：
[1]中华人民共和国国家卫生健康委员会 新型冠状病毒肺炎防控方案（第七版）
[2]李振昊 高小玲等 新型冠状病毒核酸检测分析[J]《检验医学与临床》 2020 年5月第17卷第10期 1313
[3]丽娟 陈大洋等 新型冠状病毒核酸检测的主要影响因素及控制措施[J]《临床检验杂志》2020年3月38卷第3期223
[4]江西省疾控机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行）
铅山县疾病预防控制中心 江西上饶 334505