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【摘要】背景与目的:血培养是确定脓毒血症病因的主要手段,据统计,最常见的致病菌主要是:大肠杆菌、绿脓杆菌以及Klebsiella肺炎杆菌。但临床上有很多病例出现血培养阴性,经检查发现血清中EBV成阳性,在血清中监测EBV DNA水平对血培养阴性脓毒血症患者的临床意义尚缺少研究报道。 EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种人类疱疹病毒,基因组为双链DNA。世界上90%人群成年前均感染过EBV[1]大多数正常人携带EBV,这种原处于静止状态的病毒一旦处于活化状态。EBV DNA可整合至细胞染色体,是EBV持续潜伏感染的另一种方式,代表了病毒一细胞相互作用的又一种机制[2]。本研究定量检测脓毒血症血培养阴性患者血清EBV DNA含量,探讨其在监测脓毒血症发生和发展临床意义。方法:选择在我院门诊随诊的血培养阴性脓毒血症患者20例和健康成年志愿者20例,用荧光定量PCR方法检测血清EBV DNA含量,比较血培养阴性脓毒血症患者与健康成年志愿者血清EBV DNA拷贝数。结果:血培养阴性脓毒血症患者血清EBV DNA的检出率为30%,中位拷贝数为2 650 copies/ml(O -5 900 000 copies/ml);而正常对照组患者血清EBV DNA检出率0%,中位拷贝数为0 copy/ml(0 - 71000copies/ml),差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:血清EBV DNA定量检测可证明血培养阴性脓毒血症患者存在EBV感染的病毒血症。
【关键词】脓毒血症;血培养阴性;荧光定量PCR; EB病毒DNA;
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801(2014)06-0011-03
EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)
本研究拟采用荧光定量PCR技术对20例血培养阴性Sepsis患者血清EBV DNA进行定量分析,探讨血清EBV DNA含量在诊断脓毒血症中的临床意义。
1资料和方法
1.1病例资料
选择自2009年3月至2011年10月在湖南省人民医院门诊随诊的血培养阴性脓毒血非烧伤致脓毒症患者20例, 其中男性11例,女性9例,中位年龄49(23 -65)岁。原发病包括呼吸系统感染10例, 消化系统感染7例, 神经系统感染3例。治愈15例, 死亡5例。所有患者入院时均出现SIRS, 其中并发MODS 10例, 感染性休克15例。所有病例均排除其他引起血清中EBV感染可能的疾病, 无基础代谢性疾病, 未行脾及胸腺切除, 不包括肿瘤、自体免疫性疾病等确切影响免疫及使用放、化疗和激素、免疫制剂治疗者。正常对照组血清取于22-28岁健康志愿者,既往无EBV感染相关病史。抽取每个患者外周血3 ml于分离胶促凝管中,4 000 r/min离心10 min后分离上层血清,于- 80C冻存。
1.2DNA抽提
用QIAmp DNA Blood Kit(购自德国Qiagen公司)抽提血清DNA,操作方法按试剂盒说明书进行。
1.3引物及探针的设计及合成
引物、探针的设计及合成均在上海生工完成。所扩增的目的基因来自EB病毒的BamH i-w片段。上、下游引物分别为W-44F(5'-AGTCT CTGCC TCCAG GCA-3’)和W-119R(5’一ACAGA GGGCC TGTCC ACCG-3’)。在该PCR反应体系中加入一个双末端标记的荧光探针,探针的序列为5'-(FAM) CACTG TCTGT AAAGT CCAGCCTCC (TAMRA)-3’。上述引物和探针序列资料采集自GenBank序列数据库。
1.4反应体系组成
PCR反应总体积是50ul,含有10ul的5×Buffer.引物和对应的荧光标记探针各10 pmol,dATP、dCTP、dGTP和dUTP各200 umol/L,Taq聚合酶SU,取抽提的血清DNA模板5ul,加入PCR反应管中。扩增反应在PE7700自动荧光定量PCR仪上进行。结果采用专用的分析软件包SequenceDetection System software(version l.6.3)进行分析( Perkin-Elmer AppliedBiosystems)。PCR反应条件:开始95℃10 min,93℃45 s,55℃1 min,10个循环;然后95℃30 s,55℃45 s,30个循环。
1.5对照的选择
每批PCR反应用克隆合成的EBV DNA-W片段作为阳性对照,并稀释成不同浓度梯度(1×107、1×106、1×105、lx 104、1×103、1×102、1×10 copies/ul)进行PCR反应。
1.6血清中EBV DNA含量计算
血清EBV DNA拷贝数C=Qx( Vdna/Vpcr)×(l/ Vext),其中C为血清中待测DNA拷贝数( copies/ml),Q为PCR扩增后计算机检测的原始DNA拷贝数,Vdna为抽提的DNA稀释液体积,VPCR为用于PCR扩增的DNA体积,Vext用于抽提DNA的血清体积。
1.7统计学分析
两组间EBV DNA拷贝数比较采用非参数样本Mann-Whitney rank-sum检验,两组间EBV DNA阳性率比较采用卡方检验。
2结果
2.1定量标准曲线的建立
用稀释成不同浓度的EBV DNA阳性对照在PE7700型扩增仪上进行扩增反应。在PCR反应过程中,每8s实时检测一次产物量,反应结束时得出PCR扩增的动力学曲线(见图IA)及荧光定量PCR定量标准曲线(见图IB)。
图IA
图IB
Fig. IDetection of EBV DNA by real time quantitative PCR.
(A)plot corresponds to a particular input target quantity marked by a corresponding symbol. The X axis denotes the cycle number of a quantitative PCR
reaction. The Y axis denotes the △Rn. which is the fluorescence intensity over the background.(B) plot of the threshold cycle (Ct) against the input
target quantity (common log scale). The input target quantity was expressed as copies of EBV DNA.
2.2血培养阴性Sepsis患者血清EBV DNA含量变化
20例血培养阴性Sepsis患者血清EBVDNA的检出率为30%,中位拷贝数为2 650 copies/ml(0 -5 900 000 copies/ml).
2.3正常对照组血清EBV DNA含量变化
20例正常对照组中有0例血清中检测到EBV DNA 0%,EBV DNA中位拷贝数为0 copy/ml(0 - 71 000 copies/ml)。
2.4血培养阴性Sepsis患者和正常对照组血清EBV DNA含量比较
血培养阴性Sepsis患者血清EBV DNA检出率为30%,明显高于正常对照组血清EBV DNA检出率0%(P<0. 001. Chi-square Test)。Sepsis血培养阴性患者血清EBV DNA的拷贝数(中位数2 650 copies/ml)明显高于正常对照组(中位数0 copy/ml),两组差异有统计学意义(P<0.001,Mann-Whitney rank-sum test)。
3讨论
目前,脓毒症的病死率高达30 %~50 % ,一旦并发休克和多器官衰竭,其病死率可达80 %~90 %。脓毒症的级联式炎性反应、凝血功能激活和纤溶功能受损最终可导致微循环障碍、多器官损伤和死亡[3]。在脓毒症的处理中常见的问题有:未能尽早发现重症患者、扩容不足、抗生素的使用太晚或剂量不足、心功能保护不当、血糖控制不当、急性肺损伤时未能使用低潮气量和低气压通气,在顽固性休克时未能有效治疗肾功能不全[4]。
血培养阳性是诊断Sepsis的重要证据之一。但是血培养阴性的病例在临床上也比较多见, 通过对本次研究的20例血培养阴性的Sepsis患者的病史调查发现,血培养阴性容易对该疾病的诊断产生延误,有研究表明:血培养阴性Sepsis患者的临床表现(如发热、恶心、呕吐、脉快、头痛,嗜睡,脱水,酸中毒)较血培养阳性的Sepsis患者低[5,6]。因此在血培养阴性的病例中及时找出病因显得尤为重要。病毒血症在我国比较常见,其早期症状和Sepsis患者比较相似,容易混淆[7]。其中以HBV隐性感染为甚,因此血培养阴性的Sepsis患者很可能与多种病毒感染相关。EB病毒是一种人类疱疹病毒,基因组为双链DNA。世界上90%人群成年前均感染过EBV大多数正常人携带EBV,这种原处于静止状态的病毒一旦处于活化状态,即可变为与包括肿瘤在内很多疾病相关的病因。其中EBV-DNA检测在血培养阴性的Sepsis患者有一定的表达,血培养阴性患者中可能EBV感染并导致病毒血症。 Real-time定量PCR技术是运用荧光探针、通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中的荧光信号变化,反映PCR扩增动力学变化,实现实时定量检测,具有快速、准确、不易被污染等优点。
本研究应用荧光定量PCR分析血培养阴性脓毒血症血清中EBV DNA含量,发现30%的血培养阴性脓毒血症患者血清可以检出EBV DNA,而正常对照组患者仅0%可以检测出EBV DNA。血培养阴性脓毒血症组患者血清EBV DNA含量(中位数2 650 copies/ml),显著高于正常对照组患者的EBV DNA含量(中位数0 copy/ml)。提示血培养阴性Sepsis患者血清EBV DNA含量明显升高,对治疗后随诊脓毒血症患者血清EBV DNA进行定量检测有助于监测患者的预后[8,9]。
参考文献:
[1]Rickinson A B , Kieff E.Epstein-Barr virus [M]//KnipeD M,Howley P M. Fields Virology.Philadelphia:Lippin-cott/Williams&Wilkins ,200 I : 25 7 5 -2627 .
[2]Alazard N.Gruffat H.Hiriart E.et al.Differential hyper-acetylation of histones H3 and H4 upon promoter-specific re-cruitment of EBWA2inEpstein - Barr viruschromatin [J].J Virol. 2003,77(14):8166-8172.
[3]Kieff E.Epstein-Barr virus and its replication [M] //FieldsB N,Knipe D M,Howly P M.Fields Virology.Philade-phia: Lippincott - Raven,1996:2397-2446 .
[4]Takakuwa T,Luo W J,Ham M F,et al.Integration of Epstein -Barr virus into chromosome 6 ql 5 0f Burkitt lympho-ma cell line (Raji) induce loss of BACH2 expression[J].Am J Pathol. 2004,164 (3):967-974.
[5]Delecluse H J.Bartnizke S,Hammerschmidt W,et al. Epi-somal and integrated copies of Epstein-Barr virus coexist in Burkitt lymphoma cell lines [J].J Virol,1993.67(3):1292-1299.
[6]Daibata M,Taguchi T,Nemoto Y,et al. Epstein - Barr virus(EBV)-positive pyothorax-associated lymphoma (PAL): chromoso-
mal integration of EBV in a novel CD2 -positive PALB-cell line [J].Br J Haematol, 2002, 117(3 ):546-557.
[7]Chang Y,Cheng S D,Tsai C H. Chromosomal integration ofEpstein-Barr virus genomes in nasopharyngeal carcinomacells [J]. Head Neck,2002,24(2):143-150.
[8]Lestou V S,De Braekeleer M.StrehlS,et al. Non-ran-dom integration of Epstein-Barr virus in lymphoblastoid celllines [J].C.en Chrom Cancer . 1993,8(I) :38 -48.
[9]Luo W J,Takakuwa'r,Ham M F,et al. Epstein-Barr virus is integrated between REL and BCL-IIA in AmericanBurkitt lymphoma cell line (NAB-2) [J].Lab Invest.2004,84 (9):1193-1199.
【关键词】脓毒血症;血培养阴性;荧光定量PCR; EB病毒DNA;
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801(2014)06-0011-03
EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)
本研究拟采用荧光定量PCR技术对20例血培养阴性Sepsis患者血清EBV DNA进行定量分析,探讨血清EBV DNA含量在诊断脓毒血症中的临床意义。
1资料和方法
1.1病例资料
选择自2009年3月至2011年10月在湖南省人民医院门诊随诊的血培养阴性脓毒血非烧伤致脓毒症患者20例, 其中男性11例,女性9例,中位年龄49(23 -65)岁。原发病包括呼吸系统感染10例, 消化系统感染7例, 神经系统感染3例。治愈15例, 死亡5例。所有患者入院时均出现SIRS, 其中并发MODS 10例, 感染性休克15例。所有病例均排除其他引起血清中EBV感染可能的疾病, 无基础代谢性疾病, 未行脾及胸腺切除, 不包括肿瘤、自体免疫性疾病等确切影响免疫及使用放、化疗和激素、免疫制剂治疗者。正常对照组血清取于22-28岁健康志愿者,既往无EBV感染相关病史。抽取每个患者外周血3 ml于分离胶促凝管中,4 000 r/min离心10 min后分离上层血清,于- 80C冻存。
1.2DNA抽提
用QIAmp DNA Blood Kit(购自德国Qiagen公司)抽提血清DNA,操作方法按试剂盒说明书进行。
1.3引物及探针的设计及合成
引物、探针的设计及合成均在上海生工完成。所扩增的目的基因来自EB病毒的BamH i-w片段。上、下游引物分别为W-44F(5'-AGTCT CTGCC TCCAG GCA-3’)和W-119R(5’一ACAGA GGGCC TGTCC ACCG-3’)。在该PCR反应体系中加入一个双末端标记的荧光探针,探针的序列为5'-(FAM) CACTG TCTGT AAAGT CCAGCCTCC (TAMRA)-3’。上述引物和探针序列资料采集自GenBank序列数据库。
1.4反应体系组成
PCR反应总体积是50ul,含有10ul的5×Buffer.引物和对应的荧光标记探针各10 pmol,dATP、dCTP、dGTP和dUTP各200 umol/L,Taq聚合酶SU,取抽提的血清DNA模板5ul,加入PCR反应管中。扩增反应在PE7700自动荧光定量PCR仪上进行。结果采用专用的分析软件包SequenceDetection System software(version l.6.3)进行分析( Perkin-Elmer AppliedBiosystems)。PCR反应条件:开始95℃10 min,93℃45 s,55℃1 min,10个循环;然后95℃30 s,55℃45 s,30个循环。
1.5对照的选择
每批PCR反应用克隆合成的EBV DNA-W片段作为阳性对照,并稀释成不同浓度梯度(1×107、1×106、1×105、lx 104、1×103、1×102、1×10 copies/ul)进行PCR反应。
1.6血清中EBV DNA含量计算
血清EBV DNA拷贝数C=Qx( Vdna/Vpcr)×(l/ Vext),其中C为血清中待测DNA拷贝数( copies/ml),Q为PCR扩增后计算机检测的原始DNA拷贝数,Vdna为抽提的DNA稀释液体积,VPCR为用于PCR扩增的DNA体积,Vext用于抽提DNA的血清体积。
1.7统计学分析
两组间EBV DNA拷贝数比较采用非参数样本Mann-Whitney rank-sum检验,两组间EBV DNA阳性率比较采用卡方检验。
2结果
2.1定量标准曲线的建立
用稀释成不同浓度的EBV DNA阳性对照在PE7700型扩增仪上进行扩增反应。在PCR反应过程中,每8s实时检测一次产物量,反应结束时得出PCR扩增的动力学曲线(见图IA)及荧光定量PCR定量标准曲线(见图IB)。
图IA
图IB
Fig. IDetection of EBV DNA by real time quantitative PCR.
(A)plot corresponds to a particular input target quantity marked by a corresponding symbol. The X axis denotes the cycle number of a quantitative PCR
reaction. The Y axis denotes the △Rn. which is the fluorescence intensity over the background.(B) plot of the threshold cycle (Ct) against the input
target quantity (common log scale). The input target quantity was expressed as copies of EBV DNA.
2.2血培养阴性Sepsis患者血清EBV DNA含量变化
20例血培养阴性Sepsis患者血清EBVDNA的检出率为30%,中位拷贝数为2 650 copies/ml(0 -5 900 000 copies/ml).
2.3正常对照组血清EBV DNA含量变化
20例正常对照组中有0例血清中检测到EBV DNA 0%,EBV DNA中位拷贝数为0 copy/ml(0 - 71 000 copies/ml)。
2.4血培养阴性Sepsis患者和正常对照组血清EBV DNA含量比较
血培养阴性Sepsis患者血清EBV DNA检出率为30%,明显高于正常对照组血清EBV DNA检出率0%(P<0. 001. Chi-square Test)。Sepsis血培养阴性患者血清EBV DNA的拷贝数(中位数2 650 copies/ml)明显高于正常对照组(中位数0 copy/ml),两组差异有统计学意义(P<0.001,Mann-Whitney rank-sum test)。
3讨论
目前,脓毒症的病死率高达30 %~50 % ,一旦并发休克和多器官衰竭,其病死率可达80 %~90 %。脓毒症的级联式炎性反应、凝血功能激活和纤溶功能受损最终可导致微循环障碍、多器官损伤和死亡[3]。在脓毒症的处理中常见的问题有:未能尽早发现重症患者、扩容不足、抗生素的使用太晚或剂量不足、心功能保护不当、血糖控制不当、急性肺损伤时未能使用低潮气量和低气压通气,在顽固性休克时未能有效治疗肾功能不全[4]。
血培养阳性是诊断Sepsis的重要证据之一。但是血培养阴性的病例在临床上也比较多见, 通过对本次研究的20例血培养阴性的Sepsis患者的病史调查发现,血培养阴性容易对该疾病的诊断产生延误,有研究表明:血培养阴性Sepsis患者的临床表现(如发热、恶心、呕吐、脉快、头痛,嗜睡,脱水,酸中毒)较血培养阳性的Sepsis患者低[5,6]。因此在血培养阴性的病例中及时找出病因显得尤为重要。病毒血症在我国比较常见,其早期症状和Sepsis患者比较相似,容易混淆[7]。其中以HBV隐性感染为甚,因此血培养阴性的Sepsis患者很可能与多种病毒感染相关。EB病毒是一种人类疱疹病毒,基因组为双链DNA。世界上90%人群成年前均感染过EBV大多数正常人携带EBV,这种原处于静止状态的病毒一旦处于活化状态,即可变为与包括肿瘤在内很多疾病相关的病因。其中EBV-DNA检测在血培养阴性的Sepsis患者有一定的表达,血培养阴性患者中可能EBV感染并导致病毒血症。 Real-time定量PCR技术是运用荧光探针、通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中的荧光信号变化,反映PCR扩增动力学变化,实现实时定量检测,具有快速、准确、不易被污染等优点。
本研究应用荧光定量PCR分析血培养阴性脓毒血症血清中EBV DNA含量,发现30%的血培养阴性脓毒血症患者血清可以检出EBV DNA,而正常对照组患者仅0%可以检测出EBV DNA。血培养阴性脓毒血症组患者血清EBV DNA含量(中位数2 650 copies/ml),显著高于正常对照组患者的EBV DNA含量(中位数0 copy/ml)。提示血培养阴性Sepsis患者血清EBV DNA含量明显升高,对治疗后随诊脓毒血症患者血清EBV DNA进行定量检测有助于监测患者的预后[8,9]。
参考文献:
[1]Rickinson A B , Kieff E.Epstein-Barr virus [M]//KnipeD M,Howley P M. Fields Virology.Philadelphia:Lippin-cott/Williams&Wilkins ,200 I : 25 7 5 -2627 .
[2]Alazard N.Gruffat H.Hiriart E.et al.Differential hyper-acetylation of histones H3 and H4 upon promoter-specific re-cruitment of EBWA2inEpstein - Barr viruschromatin [J].J Virol. 2003,77(14):8166-8172.
[3]Kieff E.Epstein-Barr virus and its replication [M] //FieldsB N,Knipe D M,Howly P M.Fields Virology.Philade-phia: Lippincott - Raven,1996:2397-2446 .
[4]Takakuwa T,Luo W J,Ham M F,et al.Integration of Epstein -Barr virus into chromosome 6 ql 5 0f Burkitt lympho-ma cell line (Raji) induce loss of BACH2 expression[J].Am J Pathol. 2004,164 (3):967-974.
[5]Delecluse H J.Bartnizke S,Hammerschmidt W,et al. Epi-somal and integrated copies of Epstein-Barr virus coexist in Burkitt lymphoma cell lines [J].J Virol,1993.67(3):1292-1299.
[6]Daibata M,Taguchi T,Nemoto Y,et al. Epstein - Barr virus(EBV)-positive pyothorax-associated lymphoma (PAL): chromoso-
mal integration of EBV in a novel CD2 -positive PALB-cell line [J].Br J Haematol, 2002, 117(3 ):546-557.
[7]Chang Y,Cheng S D,Tsai C H. Chromosomal integration ofEpstein-Barr virus genomes in nasopharyngeal carcinomacells [J]. Head Neck,2002,24(2):143-150.
[8]Lestou V S,De Braekeleer M.StrehlS,et al. Non-ran-dom integration of Epstein-Barr virus in lymphoblastoid celllines [J].C.en Chrom Cancer . 1993,8(I) :38 -48.
[9]Luo W J,Takakuwa'r,Ham M F,et al. Epstein-Barr virus is integrated between REL and BCL-IIA in AmericanBurkitt lymphoma cell line (NAB-2) [J].Lab Invest.2004,84 (9):1193-1199.