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摘要 [目的]了解邻二氯苯对斑马鱼的急性毒性。[方法]采用静态试验法，参照《水和废水监测分析方法（第四版）》中有关急性毒性方法测定邻二氯苯对斑马鱼的急性毒性。[结果]邻二氯苯对斑马鱼96 h的半数致死浓度（LC50）为5.13 mg/L，安全质量浓度（SC）为0.51 mg/L。[结论]根据鱼类急性毒性分级标准，邻二氯苯属于高毒性物质。
关键词 邻二氯苯；急性毒性；斑马鱼；安全浓度
中图分类号 S931.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）19-091-02
斑马鱼具有价格低廉、容易获得、管理饲养易行等诸多优点，而且斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上进行药物试验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视并广泛应用于环境毒理学的模式生物[1-3]。
邻二氯苯是重要的农药、医药和染料中间体和聚氨酯TDI溶剂，用于制造氟氯苯胺、三氯杀虫酯、二氯苯胺、邻苯二酚、沙星类抗淋病药、氟哌酸，此外还广泛用作树脂、焦油、沥青、橡胶等溶剂以及金属防腐剂、脱脂剂、有机载热剂等。邻二氯苯在农药方面主要用于生产蚊蝇净、五氯硝基苯苄嘧费隆，还可用于制造水稻专用除草剂如丙基缩苯胺、敌草隆和利谷隆等。邻二氯苯还广泛用作有机物和有色金属氧化物的溶剂、防腐剂，也用作杀虫剂。目前关于邻二氯苯的研究主要集中在合成和测定上，关于其毒性方面的报道很少。为此，笔者研究了邻二氯苯对斑马鱼的急性毒性[4-5]，旨在为邻二氯苯的毒性评价提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与仪器。
邻二氯苯（含量大于98%）和助溶剂二甲亚砜（含量大于98%）均购自上海安谱科学仪器有限公司，由德国CNW科技公司生产。德国 Eppendorf移液枪、METTLER AL204电子分析天平、5 L玻璃圆形水槽。
1.1.2 试验用鱼。
试验斑马鱼购自无锡市南禅寺花鸟鱼市场，平均体重为（0.20±0.02）g，平均体长为（2.4±0.2）cm。试验前经筛选并在水族箱中驯养10 d以上，自然死亡率低于2%，驯养期间每日定时投颗粒饵料，试验前1 d开始禁食，选择活动性强的健康鱼供试验用，试验期间不喂食。
1.1.3 试验用水。试验用水为曝气3 d后除氯的自来水，pH 7.02～7.06，总硬度为8.10～8.15（德国度），水质溶氧量保持在5 mg/L以上。水中含Zn 0.02 mg/L、Fe 0.05 mg/L，Pb、Cu和Cd未检出。水质化学需氧量（COD）为2.05～2.25 mg/L，水温为（27±1）℃。
1.2 试验方法 按国家环境保护总局等编著的《水和废水监测分析方法（第四版）》[6]中有关急性毒性方法进行测定。
采用静态试验法，设定邻二氯苯浓度梯度为1、3、5、8、10 mg/L。在水槽中装入3 L曝气自来水，每槽饲养斑马鱼10尾， 根据所设置的浓度分别加入一定体积的邻二氯苯储备液，配制成5个浓度梯度，每个浓度设置3个平行，同时设空白对照和助溶剂对照组。试验期间不喂食，前8 h连续观察，记录鱼的反应情况，及时捞出死亡个体，随后在24、48、72、96 h观察鱼死亡情况并记录。判断死亡标准：鱼腹部向上，鳃盖停止运动，用玻璃棒或镊子反复轻击鱼的尾部，如鱼体不产生任何应激反应，即判定死亡。
1.3 数据处理 根据各组试验鱼在24、48、72、96 h的死亡数计算平均死亡率，再转化为概率单位，计算出试验液浓度的对数。用直线回归法求出概率单位数与试验液浓度对数的回归方程，然后根据方程分别求出邻二氯苯在24、48、72、96 h对鱼类的LC50[6]。SC采用常规方法计算：SC=96 h LC50×0.1[6]。
2 结果与分析
在邻二氯苯对斑马鱼的96 h急性毒性试验期间观察发现，1 mg/L组用药后72 h斑马鱼开始死亡，96 h死亡率为10%；3 mg/L组用药后48 h斑马鱼开始死亡，48 h死亡率为20%，96 h死亡率为20%；5 mg/L组用药后20 h斑马鱼开始死亡，96 h死亡率为40%；8 mg/L组用药后12 h斑马鱼开始死亡，96 h死亡率为70%；10 mg/L组用药后7 h斑马鱼开始死亡，96 h死亡率为80%；空白对照和助溶剂对照组96 h内斑马鱼不死亡（表1）。
斑马鱼放入邻二氯苯溶液中，随着邻二氯苯浓度的增加，斑马鱼中毒现象严重。在高质量浓度组斑马鱼7 h即开始出现死亡现象，死亡前游动缓慢、侧翻、仰游，呼吸深度加强，鳃盖张开幅度大。
随着时间的延长各试验浓度组的斑马鱼死亡率均呈增加趋势，而同一时间下，高浓度组的死亡率明显高于低浓度组。由此可见，邻二氯苯对斑马鱼的毒性作用随其暴露时间的延长和暴露浓度的增大而增强。
邻二氯苯对斑马鱼24、48、72和96 h的LC50值分别为60.87、14.00、7.58和5.13 mg/L，SC为0.51 mg/L。按照鱼类急性毒性分级标准[6]，邻二氯苯属于高毒性物质。
3 结论与讨论
试验结果表明，邻二氯苯对斑马鱼的96 h LC50值为5.13 mg/L，安全浓度为0.51 mg/L，按照鱼类急性毒性分级标准[8]，邻二氯苯属于高毒性物质。国内常用的杀虫剂六六六等都会对受试鱼类产生生物富集[7]、遗传毒性[8]，对抗氧化应激酶活[过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等][9]造成影响。邻二氯苯长期暴露对鱼类是否产生毒害及其分子生物学机制还需进一步研究。
参考文献
[1] 罗帅，李玉文，马玲，等.离子液体对斑马鱼急性毒性及保护酶活性的影响[J].安徽农业科学，2014，42（3）：786-789.
[2] 胡双庆.3种农药对斑马鱼的急性毒性及生物安全性评价[J].安徽农业科学，2011，39（35）：21698-21700.
[3] 郭晶，宋文华，丁峰，等.三唑类杀菌剂对斑马鱼急性毒性研究[J].东南大学学报：医学版，2010（4）：402-406.
[4] 刘春治.二氯苯的应用、生产技术与市场分析[J].农化新世纪，2004（11）：18-19.
[5] 王艳华.二氯苯的生产应用及其衍生产品的开发[J].沈阳化工，1996（3）：38-41.
[6] 国家环境保护总局.水和废水监测分析方法[M].4版.北京：中国环境科学出版社，2002.
[7] 梁丹涛，沈根祥，双庆，等.六六六在斑马色体内的生物富集情况研究[J].农业环境科学学报，2007， 26（S1）：509-513.
[8] 胡俊西，武向伟，庄文静.灭多威暴露下斑马鱼的组织学变化[J].漳州师范学院学报：自然科学版，2009（4）：107-111.
[9] 罗朝晖，黄煜，洪彩熔.三唑磷农药对鲫鱼肝脏过氧化氢酶活性的影响[J].安徽农业科学，2008，35（36）：11867-11868.
关键词 邻二氯苯；急性毒性；斑马鱼；安全浓度
中图分类号 S931.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）19-091-02
斑马鱼具有价格低廉、容易获得、管理饲养易行等诸多优点，而且斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上进行药物试验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视并广泛应用于环境毒理学的模式生物[1-3]。
邻二氯苯是重要的农药、医药和染料中间体和聚氨酯TDI溶剂，用于制造氟氯苯胺、三氯杀虫酯、二氯苯胺、邻苯二酚、沙星类抗淋病药、氟哌酸，此外还广泛用作树脂、焦油、沥青、橡胶等溶剂以及金属防腐剂、脱脂剂、有机载热剂等。邻二氯苯在农药方面主要用于生产蚊蝇净、五氯硝基苯苄嘧费隆，还可用于制造水稻专用除草剂如丙基缩苯胺、敌草隆和利谷隆等。邻二氯苯还广泛用作有机物和有色金属氧化物的溶剂、防腐剂，也用作杀虫剂。目前关于邻二氯苯的研究主要集中在合成和测定上，关于其毒性方面的报道很少。为此，笔者研究了邻二氯苯对斑马鱼的急性毒性[4-5]，旨在为邻二氯苯的毒性评价提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与仪器。
邻二氯苯（含量大于98%）和助溶剂二甲亚砜（含量大于98%）均购自上海安谱科学仪器有限公司，由德国CNW科技公司生产。德国 Eppendorf移液枪、METTLER AL204电子分析天平、5 L玻璃圆形水槽。
1.1.2 试验用鱼。
试验斑马鱼购自无锡市南禅寺花鸟鱼市场，平均体重为（0.20±0.02）g，平均体长为（2.4±0.2）cm。试验前经筛选并在水族箱中驯养10 d以上，自然死亡率低于2%，驯养期间每日定时投颗粒饵料，试验前1 d开始禁食，选择活动性强的健康鱼供试验用，试验期间不喂食。
1.1.3 试验用水。试验用水为曝气3 d后除氯的自来水，pH 7.02～7.06，总硬度为8.10～8.15（德国度），水质溶氧量保持在5 mg/L以上。水中含Zn 0.02 mg/L、Fe 0.05 mg/L，Pb、Cu和Cd未检出。水质化学需氧量（COD）为2.05～2.25 mg/L，水温为（27±1）℃。
1.2 试验方法 按国家环境保护总局等编著的《水和废水监测分析方法（第四版）》[6]中有关急性毒性方法进行测定。
采用静态试验法，设定邻二氯苯浓度梯度为1、3、5、8、10 mg/L。在水槽中装入3 L曝气自来水，每槽饲养斑马鱼10尾， 根据所设置的浓度分别加入一定体积的邻二氯苯储备液，配制成5个浓度梯度，每个浓度设置3个平行，同时设空白对照和助溶剂对照组。试验期间不喂食，前8 h连续观察，记录鱼的反应情况，及时捞出死亡个体，随后在24、48、72、96 h观察鱼死亡情况并记录。判断死亡标准：鱼腹部向上，鳃盖停止运动，用玻璃棒或镊子反复轻击鱼的尾部，如鱼体不产生任何应激反应，即判定死亡。
1.3 数据处理 根据各组试验鱼在24、48、72、96 h的死亡数计算平均死亡率，再转化为概率单位，计算出试验液浓度的对数。用直线回归法求出概率单位数与试验液浓度对数的回归方程，然后根据方程分别求出邻二氯苯在24、48、72、96 h对鱼类的LC50[6]。SC采用常规方法计算：SC=96 h LC50×0.1[6]。
2 结果与分析
在邻二氯苯对斑马鱼的96 h急性毒性试验期间观察发现，1 mg/L组用药后72 h斑马鱼开始死亡，96 h死亡率为10%；3 mg/L组用药后48 h斑马鱼开始死亡，48 h死亡率为20%，96 h死亡率为20%；5 mg/L组用药后20 h斑马鱼开始死亡，96 h死亡率为40%；8 mg/L组用药后12 h斑马鱼开始死亡，96 h死亡率为70%；10 mg/L组用药后7 h斑马鱼开始死亡，96 h死亡率为80%；空白对照和助溶剂对照组96 h内斑马鱼不死亡（表1）。
斑马鱼放入邻二氯苯溶液中，随着邻二氯苯浓度的增加，斑马鱼中毒现象严重。在高质量浓度组斑马鱼7 h即开始出现死亡现象，死亡前游动缓慢、侧翻、仰游，呼吸深度加强，鳃盖张开幅度大。
随着时间的延长各试验浓度组的斑马鱼死亡率均呈增加趋势，而同一时间下，高浓度组的死亡率明显高于低浓度组。由此可见，邻二氯苯对斑马鱼的毒性作用随其暴露时间的延长和暴露浓度的增大而增强。
邻二氯苯对斑马鱼24、48、72和96 h的LC50值分别为60.87、14.00、7.58和5.13 mg/L，SC为0.51 mg/L。按照鱼类急性毒性分级标准[6]，邻二氯苯属于高毒性物质。
3 结论与讨论
试验结果表明，邻二氯苯对斑马鱼的96 h LC50值为5.13 mg/L，安全浓度为0.51 mg/L，按照鱼类急性毒性分级标准[8]，邻二氯苯属于高毒性物质。国内常用的杀虫剂六六六等都会对受试鱼类产生生物富集[7]、遗传毒性[8]，对抗氧化应激酶活[过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等][9]造成影响。邻二氯苯长期暴露对鱼类是否产生毒害及其分子生物学机制还需进一步研究。
参考文献
[1] 罗帅，李玉文，马玲，等.离子液体对斑马鱼急性毒性及保护酶活性的影响[J].安徽农业科学，2014，42（3）：786-789.
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[3] 郭晶，宋文华，丁峰，等.三唑类杀菌剂对斑马鱼急性毒性研究[J].东南大学学报：医学版，2010（4）：402-406.
[4] 刘春治.二氯苯的应用、生产技术与市场分析[J].农化新世纪，2004（11）：18-19.
[5] 王艳华.二氯苯的生产应用及其衍生产品的开发[J].沈阳化工，1996（3）：38-41.
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[7] 梁丹涛，沈根祥，双庆，等.六六六在斑马色体内的生物富集情况研究[J].农业环境科学学报，2007， 26（S1）：509-513.
[8] 胡俊西，武向伟，庄文静.灭多威暴露下斑马鱼的组织学变化[J].漳州师范学院学报：自然科学版，2009（4）：107-111.
[9] 罗朝晖，黄煜，洪彩熔.三唑磷农药对鲫鱼肝脏过氧化氢酶活性的影响[J].安徽农业科学，2008，35（36）：11867-11868.