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摘要：为了提升水生动物医学专业实验课的质量，在《水生动物病原微生物学实验》中进行改革探索，设计了“嗜水气单胞菌人工感染异育银鲫及病原菌的分离、鉴定综合性大实验”的案例，巩固了学生对“科赫法则”的理解和运用。该实验项目极大地提高了学生的动手能力和实验兴趣，取得了良好的教学效果。
关键词：水生动物病原微生物学实验；科赫法则；综合性实验；实验改革
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2018）21-0271-02
一、引言
“水生动物医学”（090604TK）是2013年被教育部首次批准于上海海洋大学的水产学大类下设置的新本科专业，为国内首个水生动物疾病防控领域的本科专业。《水生动物病原微生物学实验》是针对“水生动物医学”新专业开设的专业必修课程之一，其理论课是《水生动物病原微生物学》。为了满足市场对水生动物医学专业人才极其匮乏的需求，《水生动物病原微生物学实验》承载着该专业重要的专业技能训练使命[1]。该课程从无到中有，经历了逐步完善的过程，为了提升该专业综合性大实验的比例，提高学生的综合性大实验的技能，我们设计了“嗜水气单胞菌人工感染异育银鲫及病原菌的分离、鉴定”综合性大实验的案例。历经4年的实施与改革，取得了很好的实验效果，对进一步深化教学改革具有重要借鉴意义。
二、实验设计的理念
参考《致病性嗜水气单胞菌检验方法GB/T 18652-2002》（2002-02-19发布2002-05-01实施，中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布）的标准，在《水生动物病原微生物学实验》专业微生物学实验环节，针对病原菌部分的教学重点，根据“科赫法则”设立了“嗜水气单胞菌人工感染异育银鲫及病原菌的分离、鉴定综合性大实验”，旨在建立病原菌的感染模型，锻炼学生分离、鉴定以及保藏病原菌的综合能力。训练学生灵活运用理论知识的能力，融合前面单独实验项目中的操作技巧，综合运用到本实验项目中，进一步锻炼学生的团结协作能力。
三、实验目的和要求
通过致病性嗜水气单胞菌人工感染异育银鲫，了解细菌的培养及人工感染方法；观察嗜水气单胞菌感染鱼体后所造成的疾病症状，包括体表以及体内的病理变化特征；掌握病原菌的体外及体内分离、培养方法，掌握细菌传统鉴定及16S rRNA分子鉴定方法，理解科赫法则，训练病原菌保藏的技术。以4-5人为一组，分6个学时进行。
四、实验内容和方法
1.实验器材：培养皿、干燥箱、灭菌锅；塑料水族箱（90L）、加热棒、充气泵、解剖刀、解剖盘、剪刀、镊子、酒精灯、接种环、酒精棉、1mL无菌注射器、试管、火柴、一次性手套、橡胶手套、口罩；营养琼脂、无菌脱纤维羊血、血琼脂基础培养基、RS琼脂、无菌生理盐水、MS-222麻醉剂。
2.实验菌株：实验室保藏致病性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophilia，Ah），菌株编号Ah-js16。
3.实验原理：本综合性试验项目设计的原理依据科赫法则（Koch postulates），又称证病律。
4.实验操作步骤：（1）实验准备：包括实验鱼的驯养和实验菌株的活化和扩大培养。（2）人工感染：实验鱼人工感染方法包括浸泡、创伤感染、肌肉注射以及腹腔注射，本实验采用腹腔注射，感染快速、效果较好。感染后，观察并记录发病情况。（3）病原菌的分离、培养：分别观察记录人工感染后4 h、8 h、16 h、24 h鱼体症状，之后进行病鱼的解剖及病原菌的平板划线分离。（4）病原菌鉴定：细菌的鉴定方法主要包括传统鉴定和现代分类鉴定两种方法。本实验采用的传统鉴定方法包括：生长特性、菌落特征、革兰氏染色、运动性、氧化酶、吲哚试验、糖发酵实验、细菌的致病性检查共8个项目。细菌的现代分类鉴定采用16S rRNA序列测定，操作简单（菌液直接送公司进行测序），节省时间，花费低廉（30-50元/菌株）。根据测序结果构建系统进化树，登陆NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），再次确认其分类地位。（5）实验鱼及菌株处理：实验解剖后的感染鱼及分离菌株应进行无害化处理，先经121℃灭菌15min后，再进行后续处理。（6）病原菌的保藏：将分离鉴定后的病原菌株，进行液体扩大培养，之后按照甘油：菌悬液=3∶7的比例，进行混合，之后分装1-2ml菌种冻存管，9管/株，分别置于-20℃，-70℃，-196℃（每个温度各3管）进行保存、备用。
五、实验考核方法
综合学生之间互动的积极性、实验小组的团队协作精神、实验报告中体现出来的应用所学知识分析和解释实验结果的能力给出该组的成绩，分为优、良、中、及格、不及格五级。
六、学生对实验的评价与反馈
通过该综合性大实验，学生牢固强化了微生物学的基本操作技巧，对于无菌操作能够贯穿实验的全过程，对于“病原微生物”的理解更加透彻，对于“科赫法则”十分清楚。下面仅举2例，展示学生的实际收获及实验效果。
例1：“本次实验相对比较成功，组内同学彼此配合默契，分工明确，通过此次实验有利于培养对病原微生物学的兴趣，对同学们的独立思考能力是一个非常好的锻炼机会。”
例2：“这学期的水生动物病原微生物实验已经结束，这是我们第一次接触到微生物的真实世界，开始实验之前我以为这个实验不会很难，但是通过本实验的逐步完成发现这个课程很有技术含量。不仅需要理论知识作为铺垫，还需要有严谨的实验精神。通过这次实验操作，我们学到了很多，非常有收获。”
七、总结和提高
该综合性大实验，确立了以学生为中心的互动实验教学模式[2]，明显提高了实验教学的质量和学生的综合素质，提升了教学团队的整体实力。学生的实验报告图文并茂，很多照片也成为科学出版社的待出版教材《水生动物病原微生物学实验》的素材，因此，对同行有一定的参考和帮助。今后如何面对高等教育现代化对课程内涵不断提升的需求，培养具有国际竞爭力的人才，仍需要更多的思考和实践。希望此实验案例能够抛砖引玉，与同道共勉。
参考文献：
[1]张庆华，宋增福，郭婧，等.“水生动物病原微生物学”实验的教学与实践[J].实验科学与技术，2016，14（6）：130-133，245.
[2]梅芸，杨华山.以学生为中心的互动实验教学模式探索[J].实验科学与技术，2014，12（2）：111-113.
关键词：水生动物病原微生物学实验；科赫法则；综合性实验；实验改革
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2018）21-0271-02
一、引言
“水生动物医学”（090604TK）是2013年被教育部首次批准于上海海洋大学的水产学大类下设置的新本科专业，为国内首个水生动物疾病防控领域的本科专业。《水生动物病原微生物学实验》是针对“水生动物医学”新专业开设的专业必修课程之一，其理论课是《水生动物病原微生物学》。为了满足市场对水生动物医学专业人才极其匮乏的需求，《水生动物病原微生物学实验》承载着该专业重要的专业技能训练使命[1]。该课程从无到中有，经历了逐步完善的过程，为了提升该专业综合性大实验的比例，提高学生的综合性大实验的技能，我们设计了“嗜水气单胞菌人工感染异育银鲫及病原菌的分离、鉴定”综合性大实验的案例。历经4年的实施与改革，取得了很好的实验效果，对进一步深化教学改革具有重要借鉴意义。
二、实验设计的理念
参考《致病性嗜水气单胞菌检验方法GB/T 18652-2002》（2002-02-19发布2002-05-01实施，中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布）的标准，在《水生动物病原微生物学实验》专业微生物学实验环节，针对病原菌部分的教学重点，根据“科赫法则”设立了“嗜水气单胞菌人工感染异育银鲫及病原菌的分离、鉴定综合性大实验”，旨在建立病原菌的感染模型，锻炼学生分离、鉴定以及保藏病原菌的综合能力。训练学生灵活运用理论知识的能力，融合前面单独实验项目中的操作技巧，综合运用到本实验项目中，进一步锻炼学生的团结协作能力。
三、实验目的和要求
通过致病性嗜水气单胞菌人工感染异育银鲫，了解细菌的培养及人工感染方法；观察嗜水气单胞菌感染鱼体后所造成的疾病症状，包括体表以及体内的病理变化特征；掌握病原菌的体外及体内分离、培养方法，掌握细菌传统鉴定及16S rRNA分子鉴定方法，理解科赫法则，训练病原菌保藏的技术。以4-5人为一组，分6个学时进行。
四、实验内容和方法
1.实验器材：培养皿、干燥箱、灭菌锅；塑料水族箱（90L）、加热棒、充气泵、解剖刀、解剖盘、剪刀、镊子、酒精灯、接种环、酒精棉、1mL无菌注射器、试管、火柴、一次性手套、橡胶手套、口罩；营养琼脂、无菌脱纤维羊血、血琼脂基础培养基、RS琼脂、无菌生理盐水、MS-222麻醉剂。
2.实验菌株：实验室保藏致病性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophilia，Ah），菌株编号Ah-js16。
3.实验原理：本综合性试验项目设计的原理依据科赫法则（Koch postulates），又称证病律。
4.实验操作步骤：（1）实验准备：包括实验鱼的驯养和实验菌株的活化和扩大培养。（2）人工感染：实验鱼人工感染方法包括浸泡、创伤感染、肌肉注射以及腹腔注射，本实验采用腹腔注射，感染快速、效果较好。感染后，观察并记录发病情况。（3）病原菌的分离、培养：分别观察记录人工感染后4 h、8 h、16 h、24 h鱼体症状，之后进行病鱼的解剖及病原菌的平板划线分离。（4）病原菌鉴定：细菌的鉴定方法主要包括传统鉴定和现代分类鉴定两种方法。本实验采用的传统鉴定方法包括：生长特性、菌落特征、革兰氏染色、运动性、氧化酶、吲哚试验、糖发酵实验、细菌的致病性检查共8个项目。细菌的现代分类鉴定采用16S rRNA序列测定，操作简单（菌液直接送公司进行测序），节省时间，花费低廉（30-50元/菌株）。根据测序结果构建系统进化树，登陆NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），再次确认其分类地位。（5）实验鱼及菌株处理：实验解剖后的感染鱼及分离菌株应进行无害化处理，先经121℃灭菌15min后，再进行后续处理。（6）病原菌的保藏：将分离鉴定后的病原菌株，进行液体扩大培养，之后按照甘油：菌悬液=3∶7的比例，进行混合，之后分装1-2ml菌种冻存管，9管/株，分别置于-20℃，-70℃，-196℃（每个温度各3管）进行保存、备用。
五、实验考核方法
综合学生之间互动的积极性、实验小组的团队协作精神、实验报告中体现出来的应用所学知识分析和解释实验结果的能力给出该组的成绩，分为优、良、中、及格、不及格五级。
六、学生对实验的评价与反馈
通过该综合性大实验，学生牢固强化了微生物学的基本操作技巧，对于无菌操作能够贯穿实验的全过程，对于“病原微生物”的理解更加透彻，对于“科赫法则”十分清楚。下面仅举2例，展示学生的实际收获及实验效果。
例1：“本次实验相对比较成功，组内同学彼此配合默契，分工明确，通过此次实验有利于培养对病原微生物学的兴趣，对同学们的独立思考能力是一个非常好的锻炼机会。”
例2：“这学期的水生动物病原微生物实验已经结束，这是我们第一次接触到微生物的真实世界，开始实验之前我以为这个实验不会很难，但是通过本实验的逐步完成发现这个课程很有技术含量。不仅需要理论知识作为铺垫，还需要有严谨的实验精神。通过这次实验操作，我们学到了很多，非常有收获。”
七、总结和提高
该综合性大实验，确立了以学生为中心的互动实验教学模式[2]，明显提高了实验教学的质量和学生的综合素质，提升了教学团队的整体实力。学生的实验报告图文并茂，很多照片也成为科学出版社的待出版教材《水生动物病原微生物学实验》的素材，因此，对同行有一定的参考和帮助。今后如何面对高等教育现代化对课程内涵不断提升的需求，培养具有国际竞爭力的人才，仍需要更多的思考和实践。希望此实验案例能够抛砖引玉，与同道共勉。
参考文献：
[1]张庆华，宋增福，郭婧，等.“水生动物病原微生物学”实验的教学与实践[J].实验科学与技术，2016，14（6）：130-133，245.
[2]梅芸，杨华山.以学生为中心的互动实验教学模式探索[J].实验科学与技术，2014，12（2）：111-113.