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摘 要:杂交水稻汕优63(F1)线粒体代谢产热曲线以及不同浓度钕(Ⅲ)(0,8.0,15.0,20.0,40.0,60.0mg·L－1)的影响通过LKB-2277生物活性检测仪,采用安培瓶法在30℃进行检测。从所得到的代谢热曲线,计算各浓度处理组以及对照组活性恢复期速率常数(K1),最大产热功率(Pm)以及总代谢热量(Q)。结果表明,低浓度钕(Ⅲ)促进了线粒体代谢,而高浓度钕(Ⅲ)抑制了线粒体代谢,这种影响规律和稀土元素对植物的作用相吻合。
关键词:稀土元素 钕(Ⅲ) 杂交水稻 微量热 线粒体代谢产热曲线
中图分类号:S311 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2011)03(b)-0142-02
20世纪70年代以来,溶解态的稀土元素作为作物所施用肥料的组成部分被广泛应用。近年来,人们进一步认识到,稀土元素由于具有和Ca2+相近似离子半径以及更强的配位能力,对有机体具有广泛的生理和生物效应。也有许多研究表明,稀土元素能以粒子和与生物大分子结合态进入细胞和细胞器。线粒体作为细胞能量代谢中心,在生活的细胞中占据重要地位,研究稀土元素对植物线粒体的作用无疑具有重要意义。杂交水稻根系发达根呼吸旺盛,叶面积大光合强度高,比常规稻良种增产15%～20%[6]。但杂交水稻的空粒率一般比常规稻高,一是杂交水稻穗大粒多,库容量大的原因;二是在一般栽培条件下,营养物质供不应求的现象严重,即“源”与“库”存在不协调性,“库”大而“源”小。因此调整“库”与“源”的协调关系,通过增加物质来源来充实杂交水稻的库容量使其“源”和“库”相协调,就有可能提高杂交水稻的结实率和增加谷粒产量。我们拟利用不同稀土元素,对不同细胞质雄性不育类型杂交水稻线粒体代谢过程的效应机制,和稀土元素对杂交水稻细胞膜系统作用机制进行研究,观察不同稀土元素对不同类型杂交水稻生长发育和产量的影响,并指导杂交水稻的生产实践。
微量热法能直接检测生命体的生物活性并给出其连续的产热指标。这种方法非常适合于检测放热和吸热量都很细微的生命体系,比如有氧微生物、细胞体以及细胞器等。另外,这种检测法具有非特异性,这在检测复杂和特性不鲜明的生物体系时很有实用价值。
Nd3+是一种对植物有益的轻稀土元素。在本研究中,我们通过LKB-2277生物活性检测仪,获得了杂交水稻品种汕优63线粒体体外代谢在不同浓度Nd3+影响下的代谢热谱图。结果表明,低浓度对线粒体代谢有促进作用,而高浓度Nd3+则表现了明显的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 材料及设备
杂交水稻品种汕优63由湖北省种子公司提供;所用试剂和NdCl3均为分析纯,来源于上海试剂公司;TAM空气微量热计(Sweden制造),微量热计置于30℃的恒温箱中,量热信号通过计算机记录。
1.2 培养实验材料
实验用稀土NdCl3在液体培养基中设置6个浓度(分别为0,8.0,15.0,20.0,40.0, 60.0mg·L－1)处理,表1列出了液体培养基中各种营养盐和微量元素的含量。将杂交稻品种汕优63的种子在2%次氯酸钠溶液中浸泡30min,然后用蒸馏水冲洗干净,经过发芽长苗至立针期。然后将立针苗转移放置在覆盖有粗尼龙网、容量为1L、盛有不同浓度培养液的塑料容器中,在25～30℃室温下培养,培养过程中每3天替换1次培养液,pH值由0．1mol/L的HCl和0．1mol/L的NaOH溶液调整。各种营养盐和微量元素在液体培养基中的含量:营养盐KNO3的浓度/mg·L-1为51;Ca(NO3)2为82;MgSO4·7H2O为49;KH2PO4为13.6和FeEDTA为5.57;微量元素H3BO3的浓度/μg·L-1为2.86;CuSO4·5H2O为0.08;ZnSO4·7H2O为0.02;MnCl2·4H2O为1.81和H2MoO3·4H2O为0.09。
1.3 线粒体分离及微量热测定
线粒体分离提取采用梅启明[10]的方法,无菌操作;线粒体测试样品,采用双缩脲法测定蛋白质含量,给定蛋白质浓度为4.0mg·mL－1。
微量热测定采用安瓿剂法记录线粒体代谢生热曲线。参照样品为不加入NdCl3的线粒体样品液;把NdCl3最终浓度分别为0、8.0、15.0、20.0、40.0、60.0mg·L－1处理的线粒体样品和参照样品,置于恒温30℃的TAM空气微量热计的恒温箱中,开始测定并通过计算机记录。
2 结果与分析
2.1 生热曲线
分离的杂交水稻品种汕优63线粒体样品代谢生热曲线如图1。在NdCl3浓度分别为(0、8.0、15.0、20.0、40.0、60.0mg·L－1)的状态下,代谢生热曲线发生了不同的变化如图2。
2.2 热动力学
对图1、图2生热曲线的分析表明,杂交水稻品种汕优63线粒体代谢呈现4个阶段,即停滞阶段、活性恢复阶段、稳定增长阶段和衰落阶段。将不同Nd3+浓度处理的线粒体样品对比参照样品进行分析,如果时间为0时,生热速率为P0;时间为t/min时,生热速率为Pt,那么,在活性恢复阶段和衰落阶段,能量—时间曲线遵守指数公式:
Pt=P0 exp(k t)
或lnPt=lnP0+kt (1)
根据公式可以计算出活性恢复期的速率恒量K;同时,可以得到两个颇有价值的参数:Pm(最大生热量)和Q(总生热量)。所有对应值列为:CNdCl3/mg/L为0时,k/10-3min-1为3.59,R为0.9998,Pm/mW为0.5080,Q/J为79.68;当为8.0时则分别为3.99,0.999 7,0.5844和79.26;当为15.0时则分别为5.83,0.9997,0.7770和83.88;当为20.0时则分别为6.02,0.9994,0.8289和83.94;当为40.0时则分别为5.81,0.9995,0.5252和89.46;当为60.0时则分别为1.61,0.9990,0.2164和32.16。(注:k—活性恢复阶段速率恒量;R—k的相,关系数;Pm—最大生热量;Q—总生热量。)
2.2.1 活性恢复生热速率恒量K与Nd3+浓度间的关系
添加NdCl3导致活性恢复阶段生热速率恒量(K)在低浓度时升高,在高浓度时显著降低,如图3所示。
2.2.2 最大生热速率Pm与Nd3+浓度间的关系
图4表明,添加NdCl3引起最大生热速率Pm变化,在低浓度时Pm增加,在高浓度时Pm显著降低。
2.2.3 Nd3+浓度与总生热量Q间的关系
图5显示,添加处于浓度范围0-40.0mg·L－1的Nd3+对总生热量Q并不产生明显变化,而Nd3+浓度在600mg·L－1时引起线粒体的Q值显著下降。
3 结语
在本研究中,從线粒体代谢热图谱可以看出,加入NdCl3后,线粒体的代谢热曲线发生了不同的变化。使用热动力学方法对几种重要的热力学参数(K1、Pm、Q)的进一步计算发现,低浓度Nd3+对线粒体代谢具有明显的促进作用,而高浓度Nd3+则有抑制作用。具体来说,从中可见两个重要的线粒体代谢活性参数K1、Pm受0-20.0mg·L－1Nd3+刺激而增加,并且都在20.0mg·L－1达到其最大值,随着使用的Nd3+浓度进一步升高,K1、Pm都有不同程度的下降,当浓度为60.0mg·L－1时,K1只有对照组的44.8%,而Pm的百分比则是42.5%。有关低浓度稀土元素对植物生长的促进作用和高浓度对植物生长的抑制早已为人们所熟知,可惜这种作用方式在细胞器水平上的机制尚不明了。由于线粒体是生活细胞的代谢中心,本研究所得到的Nd3+对杂交水稻品种汕优63线粒体的这种类似的作用,进一步表明农用稀土元素对植物生长具有一定的作用,而这种作用可以发生在细胞器线粒体水平上。
线粒体的氧化磷酸化的作用依靠位于内膜上的5种功能复合酶的催化作用,这些酶具有一个或更多的金属离子活性中心。据报道稀土元素对生物体内酶蛋白、核苷酸等Ca2+或其他金属离子活性中心有协同作用[2],这或许是低浓度Nd3+对线粒体代谢促进作用的一种解释。因为促进各功能酶的活性[10]必然会促进线粒体的代谢活性。另据相关的稀土与生物蛋白大分子研究报道,稀土元素由于比Ca2+高的电荷密度和亲氧的配合能力,在高浓度时能与蛋白酶形成加合物。这种加合物的形成可能导致蛋白酶电荷和配体分布失衡,甚至蛋白分子构象改变,而影响了酶的正常活性功能,由此高浓度Nd3+导致线粒体代谢活性下降。
总代谢热Q与Nd3+浓度间的关系不同于K1、Pm与Nd3+浓度间的变化规律。如图5显示,当NdCl3浓度在0-40.0mg·L－1范围内Q并没有明显的变化。实际上线粒体体外代谢热可分为两个部分,除氧化磷酸化的放热外,线粒体利用本身的DNA系统复制功能酶体所需的13种多肽时也有一个放热的动作。在一般情况下,协同作用能保证线粒体绝大多数养分被氧化代谢,这是0-40.0mg·L－1 Nd3+并未导致变化的原因。至于60.0mg·L－1导致Q急速下降,应该是线粒体DNA系统受到较大的损伤,而致使其中一个放热步骤的严重障碍。
参考文献
[1] 贺爱国,彭福元,肖苏林,等.稀土在作物上应用研究进展[J].湖南农业科学,2007.
[2] 杨维东.稀土生物效应研究进展[J].稀土,2000.
[3] 郑海雷.稀土生物效应机理研究进展[J].稀土,2000.
[4] 袁隆平,唐传道.杂交水稻选育的回顾,现状与展望.中国稻米,1999(4)60.
关键词:稀土元素 钕(Ⅲ) 杂交水稻 微量热 线粒体代谢产热曲线
中图分类号:S311 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2011)03(b)-0142-02
20世纪70年代以来,溶解态的稀土元素作为作物所施用肥料的组成部分被广泛应用。近年来,人们进一步认识到,稀土元素由于具有和Ca2+相近似离子半径以及更强的配位能力,对有机体具有广泛的生理和生物效应。也有许多研究表明,稀土元素能以粒子和与生物大分子结合态进入细胞和细胞器。线粒体作为细胞能量代谢中心,在生活的细胞中占据重要地位,研究稀土元素对植物线粒体的作用无疑具有重要意义。杂交水稻根系发达根呼吸旺盛,叶面积大光合强度高,比常规稻良种增产15%～20%[6]。但杂交水稻的空粒率一般比常规稻高,一是杂交水稻穗大粒多,库容量大的原因;二是在一般栽培条件下,营养物质供不应求的现象严重,即“源”与“库”存在不协调性,“库”大而“源”小。因此调整“库”与“源”的协调关系,通过增加物质来源来充实杂交水稻的库容量使其“源”和“库”相协调,就有可能提高杂交水稻的结实率和增加谷粒产量。我们拟利用不同稀土元素,对不同细胞质雄性不育类型杂交水稻线粒体代谢过程的效应机制,和稀土元素对杂交水稻细胞膜系统作用机制进行研究,观察不同稀土元素对不同类型杂交水稻生长发育和产量的影响,并指导杂交水稻的生产实践。
微量热法能直接检测生命体的生物活性并给出其连续的产热指标。这种方法非常适合于检测放热和吸热量都很细微的生命体系,比如有氧微生物、细胞体以及细胞器等。另外,这种检测法具有非特异性,这在检测复杂和特性不鲜明的生物体系时很有实用价值。
Nd3+是一种对植物有益的轻稀土元素。在本研究中,我们通过LKB-2277生物活性检测仪,获得了杂交水稻品种汕优63线粒体体外代谢在不同浓度Nd3+影响下的代谢热谱图。结果表明,低浓度对线粒体代谢有促进作用,而高浓度Nd3+则表现了明显的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 材料及设备
杂交水稻品种汕优63由湖北省种子公司提供;所用试剂和NdCl3均为分析纯,来源于上海试剂公司;TAM空气微量热计(Sweden制造),微量热计置于30℃的恒温箱中,量热信号通过计算机记录。
1.2 培养实验材料
实验用稀土NdCl3在液体培养基中设置6个浓度(分别为0,8.0,15.0,20.0,40.0, 60.0mg·L－1)处理,表1列出了液体培养基中各种营养盐和微量元素的含量。将杂交稻品种汕优63的种子在2%次氯酸钠溶液中浸泡30min,然后用蒸馏水冲洗干净,经过发芽长苗至立针期。然后将立针苗转移放置在覆盖有粗尼龙网、容量为1L、盛有不同浓度培养液的塑料容器中,在25～30℃室温下培养,培养过程中每3天替换1次培养液,pH值由0．1mol/L的HCl和0．1mol/L的NaOH溶液调整。各种营养盐和微量元素在液体培养基中的含量:营养盐KNO3的浓度/mg·L-1为51;Ca(NO3)2为82;MgSO4·7H2O为49;KH2PO4为13.6和FeEDTA为5.57;微量元素H3BO3的浓度/μg·L-1为2.86;CuSO4·5H2O为0.08;ZnSO4·7H2O为0.02;MnCl2·4H2O为1.81和H2MoO3·4H2O为0.09。
1.3 线粒体分离及微量热测定
线粒体分离提取采用梅启明[10]的方法,无菌操作;线粒体测试样品,采用双缩脲法测定蛋白质含量,给定蛋白质浓度为4.0mg·mL－1。
微量热测定采用安瓿剂法记录线粒体代谢生热曲线。参照样品为不加入NdCl3的线粒体样品液;把NdCl3最终浓度分别为0、8.0、15.0、20.0、40.0、60.0mg·L－1处理的线粒体样品和参照样品,置于恒温30℃的TAM空气微量热计的恒温箱中,开始测定并通过计算机记录。
2 结果与分析
2.1 生热曲线
分离的杂交水稻品种汕优63线粒体样品代谢生热曲线如图1。在NdCl3浓度分别为(0、8.0、15.0、20.0、40.0、60.0mg·L－1)的状态下,代谢生热曲线发生了不同的变化如图2。
2.2 热动力学
对图1、图2生热曲线的分析表明,杂交水稻品种汕优63线粒体代谢呈现4个阶段,即停滞阶段、活性恢复阶段、稳定增长阶段和衰落阶段。将不同Nd3+浓度处理的线粒体样品对比参照样品进行分析,如果时间为0时,生热速率为P0;时间为t/min时,生热速率为Pt,那么,在活性恢复阶段和衰落阶段,能量—时间曲线遵守指数公式:
Pt=P0 exp(k t)
或lnPt=lnP0+kt (1)
根据公式可以计算出活性恢复期的速率恒量K;同时,可以得到两个颇有价值的参数:Pm(最大生热量)和Q(总生热量)。所有对应值列为:CNdCl3/mg/L为0时,k/10-3min-1为3.59,R为0.9998,Pm/mW为0.5080,Q/J为79.68;当为8.0时则分别为3.99,0.999 7,0.5844和79.26;当为15.0时则分别为5.83,0.9997,0.7770和83.88;当为20.0时则分别为6.02,0.9994,0.8289和83.94;当为40.0时则分别为5.81,0.9995,0.5252和89.46;当为60.0时则分别为1.61,0.9990,0.2164和32.16。(注:k—活性恢复阶段速率恒量;R—k的相,关系数;Pm—最大生热量;Q—总生热量。)
2.2.1 活性恢复生热速率恒量K与Nd3+浓度间的关系
添加NdCl3导致活性恢复阶段生热速率恒量(K)在低浓度时升高,在高浓度时显著降低,如图3所示。
2.2.2 最大生热速率Pm与Nd3+浓度间的关系
图4表明,添加NdCl3引起最大生热速率Pm变化,在低浓度时Pm增加,在高浓度时Pm显著降低。
2.2.3 Nd3+浓度与总生热量Q间的关系
图5显示,添加处于浓度范围0-40.0mg·L－1的Nd3+对总生热量Q并不产生明显变化,而Nd3+浓度在600mg·L－1时引起线粒体的Q值显著下降。
3 结语
在本研究中,從线粒体代谢热图谱可以看出,加入NdCl3后,线粒体的代谢热曲线发生了不同的变化。使用热动力学方法对几种重要的热力学参数(K1、Pm、Q)的进一步计算发现,低浓度Nd3+对线粒体代谢具有明显的促进作用,而高浓度Nd3+则有抑制作用。具体来说,从中可见两个重要的线粒体代谢活性参数K1、Pm受0-20.0mg·L－1Nd3+刺激而增加,并且都在20.0mg·L－1达到其最大值,随着使用的Nd3+浓度进一步升高,K1、Pm都有不同程度的下降,当浓度为60.0mg·L－1时,K1只有对照组的44.8%,而Pm的百分比则是42.5%。有关低浓度稀土元素对植物生长的促进作用和高浓度对植物生长的抑制早已为人们所熟知,可惜这种作用方式在细胞器水平上的机制尚不明了。由于线粒体是生活细胞的代谢中心,本研究所得到的Nd3+对杂交水稻品种汕优63线粒体的这种类似的作用,进一步表明农用稀土元素对植物生长具有一定的作用,而这种作用可以发生在细胞器线粒体水平上。
线粒体的氧化磷酸化的作用依靠位于内膜上的5种功能复合酶的催化作用,这些酶具有一个或更多的金属离子活性中心。据报道稀土元素对生物体内酶蛋白、核苷酸等Ca2+或其他金属离子活性中心有协同作用[2],这或许是低浓度Nd3+对线粒体代谢促进作用的一种解释。因为促进各功能酶的活性[10]必然会促进线粒体的代谢活性。另据相关的稀土与生物蛋白大分子研究报道,稀土元素由于比Ca2+高的电荷密度和亲氧的配合能力,在高浓度时能与蛋白酶形成加合物。这种加合物的形成可能导致蛋白酶电荷和配体分布失衡,甚至蛋白分子构象改变,而影响了酶的正常活性功能,由此高浓度Nd3+导致线粒体代谢活性下降。
总代谢热Q与Nd3+浓度间的关系不同于K1、Pm与Nd3+浓度间的变化规律。如图5显示,当NdCl3浓度在0-40.0mg·L－1范围内Q并没有明显的变化。实际上线粒体体外代谢热可分为两个部分,除氧化磷酸化的放热外,线粒体利用本身的DNA系统复制功能酶体所需的13种多肽时也有一个放热的动作。在一般情况下,协同作用能保证线粒体绝大多数养分被氧化代谢,这是0-40.0mg·L－1 Nd3+并未导致变化的原因。至于60.0mg·L－1导致Q急速下降,应该是线粒体DNA系统受到较大的损伤,而致使其中一个放热步骤的严重障碍。
参考文献
[1] 贺爱国,彭福元,肖苏林,等.稀土在作物上应用研究进展[J].湖南农业科学,2007.
[2] 杨维东.稀土生物效应研究进展[J].稀土,2000.
[3] 郑海雷.稀土生物效应机理研究进展[J].稀土,2000.
[4] 袁隆平,唐传道.杂交水稻选育的回顾,现状与展望.中国稻米,1999(4)60.