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[摘要]目的：探讨经尾静脉移植入体内的骨髓间充质干细胞(BMSCs)参与皮肤创面愈合的情况。方法：以SD大鼠为研究对象，分离、培养并鉴定大鼠BMSCs。制作大鼠全层皮肤缺损动物模型；经尾静脉注入经5一BrdU标记的骨髓间充质干细胞，于不同时间点(3、7、14、21、28天)观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果：经流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90表达阳性：CD45表达呈阴性；经体外标记的5一溴脱氧尿嘧啶标记率，90％；标记后的干细胞进行移植4周后，实验组大鼠创面局部及边缘可见BrdU标记的阳性细胞聚集，对照组中未发现明显的聚集现象。结论：5－BrdU完全能够满足移植细胞的标记需要。经尾静脉注射移植入体内的BMSCs可能参与皮肤创面愈合。
[关键词]骨髓间充质干细胞；5－BrdU；细胞移植；创面愈合
[中图分类号]Q813．1+1 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)01—0028－03
创伤是外科的一大类疾病，随着对创伤愈合研究的进一步深入，发现参与创面修复的细胞不仅有定居于损伤组织局部的干细胞，骨髓来源的干细胞(bone marrow derived cells)在创伤愈合中的作用逐渐受到重视。骨髓间充质干细胞(BMSCS)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adun stem cells，AS)，在一定的诱导条件下，BMSCs具有向成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞，骨骼肌、平滑肌、造血支持基质等中胚层细胞分化的能力；同时可以向外胚层的星形胶质细胞、神经元、表皮或上皮组织及内胚层的肝卵圆细胞、血管内皮细胞和心肌细胞分化。BMSCs跨系、甚至跨胚层横向分化的可塑性及其强大的分化潜能使得它可为组织修复提供各种细胞材料。
我们通过建立经体外5－BrdU标记的骨髓间充质干细胞移植和局部皮肤缺损动物模型，研究骨髓间充质干细胞在创面愈合过程中的迁移、聚集和增殖情况，以期完善对创面愈合机制的认识。
1 材料和方法
1．1材料：雄性SD大鼠(东南大学实验动物中心)，L-DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(FCS，杭州四季青生物材料有限公司)，胰蛋白酶(华美生物工程公司)，CO2培养箱(Heraeus)，荧光标记小鼠抗大鼠单克隆抗体CD45、CD29、CD90 (美国PharMingen公司)。小鼠抗大鼠BrdU单克隆抗体(美国Sigma公司)、HRP标记羊抗小鼠IgG、DAB显色剂(北京中山生物技术有限公司)，FITC标记的羊抗小鼠IgG(福州迈新公司)。
1．2方法
1．2．1骨髓间充质干细胞的分离、纯化、扩增和鉴定。
1．2．1．1细胞培养：选用六周龄健康SD大鼠(约150g，雌雄不限)引颈处死，碘酒浸泡5min，75％酒精脱碘5min：无菌条件下沿股骨髋关节股骨大转子处，剪下后肢，剔出股骨和胫骨放入培养皿，加PBS洗涤，移入培养皿加培养液；抽培养液注入股骨和胫骨，冲出骨髓，反复冲洗2～3次；将含骨髓细胞的培养液移入离心管，置离心机离心800r／min，8min弃上清液，加1ml胎牛血清，4ml培养液，(制成含20％胎牛血清培养液)与细胞混匀；移入培养瓶，放入37℃，5％CO2培养箱孵育。4天后首次换液，以后3～4天换，次，7～10天铺满瓶底，待长满80％左右进行传代。取培养的第五代细胞备用。
1．2．2．2流式细胞仪检測：流式细胞仪对P3－P5代骨髓间充质干细胞，PBS洗涤3次，加入荧光标记抗体FITC，室温避光孵育，应用流式细胞仪检测BM-SCs的表面标记：选取间质干细胞标志物：如CD29、CD90，造血干细胞典型的表面标志CD45作为鉴定指标。
1．2．2骨髓间充质干细胞的5－BrdU标记：取第五代细胞，细胞移植前48h，以含5μmol／L 5－溴脱氧尿嘧啶(5－BrdU)的培养液孵育后，0．25％胰酶室温下消化、离心，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、收集细胞。
培养瓶中置入0．5cm×1．0cm无菌玻片，当细胞铺满瓶底60％时(原代培养第9天；传代培养第5天)加入5－BrdU溶液10μl(5-BrdU，50mg；二甲基亚砜0．8ml；水1ml)．孵育48h。取出玻片，PBS冲洗，4％多聚甲醛固定15min，进行免疫组化染色鉴定。
1．2．4全层皮肤缺损动物模型的建立：戊巴比妥麻醉大鼠(30mg／kg)，在其背部脊柱两侧旁开2cm，利刀全层切除皮肤，形成直径1．8cm、面积2．54cm2的圆形全层皮肤切除创面，凡士林纱布覆盖创面，打包法处理伤口。
1．2．5实验分组：对每只动物按步骤(1．2．4)制作创伤模型，对成模动物经尾静脉注射5－BrdU标记的BMSC细胞，进一步制作BMSC细胞移植动物模型作为实验组，移植细胞数为2×107。对照组为5-Br－dU标记的BMSC移植的正常大鼠。
1．2．6免疫荧光染色：分别于创伤后3、7、14、21、28天等不同时间点分批处死动物，取创面及边缘的组织，4％甲醛固定，50％蔗糖脱水，制作连续冰冻切片，顺序加入一抗和F17C标记的二抗，以非特异血清代替一抗作为阴性对照，室温下孵育2h，PBS洗片、封片。荧光显微镜观察，5－BrdU标记的骨髓BMSCs胞核为绿色荧光。
2 结果
2．1 BMSC传代、扩增与鉴定：单个骨髓细胞悬液接种于25cm2塑料培养瓶，细胞48h开始贴壁，在瓶底呈散在圆形分布，72h后可见三角形和梭形细胞贴壁生长，换液去除未贴壁细胞。培养5～7天后细胞分裂增殖明显，出现形态均一的细胞增殖集落。培养至10天左右，90％以上细胞趋于融合。经胰酶消化后1：2传代，传代后6～8h内细胞90％以上贴壁。24h后开始增殖，细胞集落增多，呈旋涡状生长，3天可传代，连续传4～5代后MSCs趋于纯化，融合成片状。
2．2大鼠骨髓间充质干细胞表面标志抗原表达：流式细胞仪结果显示细胞均一性较好，达99％以上，造血干细胞的表面标记CD45表达呈阴性：而间充质干细胞表面标记CD29、CD90等表达阳性，说明传代贴壁生长的梭形细胞为BMSCs。
2．3骨髓间充质干细胞的5－BrdU标记情况：以5μmol／L 5－溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)的培养液孵育后，经0．25％胰酶室温下消化、离心、洗涤、收集细胞，于显微镜下观察细胞的形态。如图所示，BrdU阳性反应物位于细胞核，呈棕色、颗粒状或弥漫性分布(图3、4)；以48h作为最佳标记时间进行后续实验，随机数取10个非重叠视野进行观察(×100)， 记录阳性细胞数，标记率＞90％。
2．4大体观察：细胞移植3天后实验组动物创面有所缩小，可见新生肉芽组织生成；7天时所有创面均形成较硬的痂皮；14天时创缘有新生表皮生成：伤后21天大部分创面愈合。
2．5骨髓间充质干细胞参与创面愈合情况：细胞移植后第7、14、21、28天，实验免疫荧光化学染色，切片中均可见到经5-BrdU标记(胞核呈绿色荧光)的骨髓来源的间充质干细胞在创面边缘和创伤局部的聚集(图5)，对照组大鼠相同部位皮肤组织中未见该细胞明显的聚集现象，仅见少量5－BrdU标记的骨髓间充质干细胞的散在分布(图6)。
3 讨论
对于骨髓来源的干细胞在皮肤创面愈合中的作用，国内外的学者进行过一系列的探讨。Krause等将标记有PKH26的雄性B6D2F小鼠的骨髓干细胞注入射线照射后的免疫缺陷的雌性B6D2F小鼠体内，5至11个月后，在受体皮肤中找到了含Y染色体的细胞。方利君，艾国平等学者的研究发现，在创面微环境的诱导下，局部注射的BMSCs具有向成纤维细胞、毛细血管內皮细胞、表皮细胞乃至皮脂腺导管细胞分化的潜能。Carrie等经实验观察到在正常皮肤和创面皮肤的愈合的过程中，15％～20％的纺锤形真皮成纤维细胞来自于骨髓。由此可见，骨髓来源的干细胞在创伤愈合中的作用逐渐受到重视。
移植细胞的标记及在活体内的跟踪在此类研究中起着不可或缺的作用。目前的细胞标记方法主要有酶联标记、3H-TdR标记、荧光标记、BrdU标记法等。BrdU作为一种嘧啶类似物，在细胞处于DNA合成掺入新合成的DNA中，在胞核的DNA中长期存留，标记BrdU的细胞在不受到紫外线的照射的情况下对细胞没有功能损害。近年来，国内外已有人将该技术应用到移植细胞的存活、分化和功能状态的跟踪检测，标记和检测的准确性高、标记率高、方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖及跟踪监测移植细胞的理想指标。本实验采用BrdU标记骨髓间充质干细胞，并采用抗BrdU单克隆抗体进行免疫细胞化学染色，体外观察显示，48h后细胞标记率＞90％，细胞的形态、生长、增殖及分化未受影响。细胞移植4周后，在实验动物体内仍可检测到标记细胞的存在。
我们在对骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养、鉴定和标记的基础上，将5－BrdU标记的骨髓间充质干细胞由尾静脉注入受试鼠体内，同时制作皮肤缺损创伤模型，第1、2、3、4周处死受试鼠，经免疫荧光检测可见：经5-BrdU标记的骨髓来源的间充质干细胞在创面边缘和创伤局部的聚集(见免疫荧光照片)，而受试鼠正常皮肤组织未见该细胞的明显聚集现象，仅见5－BrdU标记的骨髓间充质干细胞的散在分布，此结果初步证实经尾静脉注入的骨髓间充质干细胞参与了创面愈合。基于此，我们将进一步研究骨髓来源的间充质干细胞在创面愈合过程中的迁移、增殖、分化情况，以期完善对创面愈合机制的认识，也为促进新的治疗手段和策略提供理论依据。
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
[关键词]骨髓间充质干细胞；5－BrdU；细胞移植；创面愈合
[中图分类号]Q813．1+1 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)01—0028－03
创伤是外科的一大类疾病，随着对创伤愈合研究的进一步深入，发现参与创面修复的细胞不仅有定居于损伤组织局部的干细胞，骨髓来源的干细胞(bone marrow derived cells)在创伤愈合中的作用逐渐受到重视。骨髓间充质干细胞(BMSCS)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adun stem cells，AS)，在一定的诱导条件下，BMSCs具有向成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞，骨骼肌、平滑肌、造血支持基质等中胚层细胞分化的能力；同时可以向外胚层的星形胶质细胞、神经元、表皮或上皮组织及内胚层的肝卵圆细胞、血管内皮细胞和心肌细胞分化。BMSCs跨系、甚至跨胚层横向分化的可塑性及其强大的分化潜能使得它可为组织修复提供各种细胞材料。
我们通过建立经体外5－BrdU标记的骨髓间充质干细胞移植和局部皮肤缺损动物模型，研究骨髓间充质干细胞在创面愈合过程中的迁移、聚集和增殖情况，以期完善对创面愈合机制的认识。
1 材料和方法
1．1材料：雄性SD大鼠(东南大学实验动物中心)，L-DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(FCS，杭州四季青生物材料有限公司)，胰蛋白酶(华美生物工程公司)，CO2培养箱(Heraeus)，荧光标记小鼠抗大鼠单克隆抗体CD45、CD29、CD90 (美国PharMingen公司)。小鼠抗大鼠BrdU单克隆抗体(美国Sigma公司)、HRP标记羊抗小鼠IgG、DAB显色剂(北京中山生物技术有限公司)，FITC标记的羊抗小鼠IgG(福州迈新公司)。
1．2方法
1．2．1骨髓间充质干细胞的分离、纯化、扩增和鉴定。
1．2．1．1细胞培养：选用六周龄健康SD大鼠(约150g，雌雄不限)引颈处死，碘酒浸泡5min，75％酒精脱碘5min：无菌条件下沿股骨髋关节股骨大转子处，剪下后肢，剔出股骨和胫骨放入培养皿，加PBS洗涤，移入培养皿加培养液；抽培养液注入股骨和胫骨，冲出骨髓，反复冲洗2～3次；将含骨髓细胞的培养液移入离心管，置离心机离心800r／min，8min弃上清液，加1ml胎牛血清，4ml培养液，(制成含20％胎牛血清培养液)与细胞混匀；移入培养瓶，放入37℃，5％CO2培养箱孵育。4天后首次换液，以后3～4天换，次，7～10天铺满瓶底，待长满80％左右进行传代。取培养的第五代细胞备用。
1．2．2．2流式细胞仪检測：流式细胞仪对P3－P5代骨髓间充质干细胞，PBS洗涤3次，加入荧光标记抗体FITC，室温避光孵育，应用流式细胞仪检测BM-SCs的表面标记：选取间质干细胞标志物：如CD29、CD90，造血干细胞典型的表面标志CD45作为鉴定指标。
1．2．2骨髓间充质干细胞的5－BrdU标记：取第五代细胞，细胞移植前48h，以含5μmol／L 5－溴脱氧尿嘧啶(5－BrdU)的培养液孵育后，0．25％胰酶室温下消化、离心，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、收集细胞。
培养瓶中置入0．5cm×1．0cm无菌玻片，当细胞铺满瓶底60％时(原代培养第9天；传代培养第5天)加入5－BrdU溶液10μl(5-BrdU，50mg；二甲基亚砜0．8ml；水1ml)．孵育48h。取出玻片，PBS冲洗，4％多聚甲醛固定15min，进行免疫组化染色鉴定。
1．2．4全层皮肤缺损动物模型的建立：戊巴比妥麻醉大鼠(30mg／kg)，在其背部脊柱两侧旁开2cm，利刀全层切除皮肤，形成直径1．8cm、面积2．54cm2的圆形全层皮肤切除创面，凡士林纱布覆盖创面，打包法处理伤口。
1．2．5实验分组：对每只动物按步骤(1．2．4)制作创伤模型，对成模动物经尾静脉注射5－BrdU标记的BMSC细胞，进一步制作BMSC细胞移植动物模型作为实验组，移植细胞数为2×107。对照组为5-Br－dU标记的BMSC移植的正常大鼠。
1．2．6免疫荧光染色：分别于创伤后3、7、14、21、28天等不同时间点分批处死动物，取创面及边缘的组织，4％甲醛固定，50％蔗糖脱水，制作连续冰冻切片，顺序加入一抗和F17C标记的二抗，以非特异血清代替一抗作为阴性对照，室温下孵育2h，PBS洗片、封片。荧光显微镜观察，5－BrdU标记的骨髓BMSCs胞核为绿色荧光。
2 结果
2．1 BMSC传代、扩增与鉴定：单个骨髓细胞悬液接种于25cm2塑料培养瓶，细胞48h开始贴壁，在瓶底呈散在圆形分布，72h后可见三角形和梭形细胞贴壁生长，换液去除未贴壁细胞。培养5～7天后细胞分裂增殖明显，出现形态均一的细胞增殖集落。培养至10天左右，90％以上细胞趋于融合。经胰酶消化后1：2传代，传代后6～8h内细胞90％以上贴壁。24h后开始增殖，细胞集落增多，呈旋涡状生长，3天可传代，连续传4～5代后MSCs趋于纯化，融合成片状。
2．2大鼠骨髓间充质干细胞表面标志抗原表达：流式细胞仪结果显示细胞均一性较好，达99％以上，造血干细胞的表面标记CD45表达呈阴性：而间充质干细胞表面标记CD29、CD90等表达阳性，说明传代贴壁生长的梭形细胞为BMSCs。
2．3骨髓间充质干细胞的5－BrdU标记情况：以5μmol／L 5－溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)的培养液孵育后，经0．25％胰酶室温下消化、离心、洗涤、收集细胞，于显微镜下观察细胞的形态。如图所示，BrdU阳性反应物位于细胞核，呈棕色、颗粒状或弥漫性分布(图3、4)；以48h作为最佳标记时间进行后续实验，随机数取10个非重叠视野进行观察(×100)， 记录阳性细胞数，标记率＞90％。
2．4大体观察：细胞移植3天后实验组动物创面有所缩小，可见新生肉芽组织生成；7天时所有创面均形成较硬的痂皮；14天时创缘有新生表皮生成：伤后21天大部分创面愈合。
2．5骨髓间充质干细胞参与创面愈合情况：细胞移植后第7、14、21、28天，实验免疫荧光化学染色，切片中均可见到经5-BrdU标记(胞核呈绿色荧光)的骨髓来源的间充质干细胞在创面边缘和创伤局部的聚集(图5)，对照组大鼠相同部位皮肤组织中未见该细胞明显的聚集现象，仅见少量5－BrdU标记的骨髓间充质干细胞的散在分布(图6)。
3 讨论
对于骨髓来源的干细胞在皮肤创面愈合中的作用，国内外的学者进行过一系列的探讨。Krause等将标记有PKH26的雄性B6D2F小鼠的骨髓干细胞注入射线照射后的免疫缺陷的雌性B6D2F小鼠体内，5至11个月后，在受体皮肤中找到了含Y染色体的细胞。方利君，艾国平等学者的研究发现，在创面微环境的诱导下，局部注射的BMSCs具有向成纤维细胞、毛细血管內皮细胞、表皮细胞乃至皮脂腺导管细胞分化的潜能。Carrie等经实验观察到在正常皮肤和创面皮肤的愈合的过程中，15％～20％的纺锤形真皮成纤维细胞来自于骨髓。由此可见，骨髓来源的干细胞在创伤愈合中的作用逐渐受到重视。
移植细胞的标记及在活体内的跟踪在此类研究中起着不可或缺的作用。目前的细胞标记方法主要有酶联标记、3H-TdR标记、荧光标记、BrdU标记法等。BrdU作为一种嘧啶类似物，在细胞处于DNA合成掺入新合成的DNA中，在胞核的DNA中长期存留，标记BrdU的细胞在不受到紫外线的照射的情况下对细胞没有功能损害。近年来，国内外已有人将该技术应用到移植细胞的存活、分化和功能状态的跟踪检测，标记和检测的准确性高、标记率高、方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖及跟踪监测移植细胞的理想指标。本实验采用BrdU标记骨髓间充质干细胞，并采用抗BrdU单克隆抗体进行免疫细胞化学染色，体外观察显示，48h后细胞标记率＞90％，细胞的形态、生长、增殖及分化未受影响。细胞移植4周后，在实验动物体内仍可检测到标记细胞的存在。
我们在对骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养、鉴定和标记的基础上，将5－BrdU标记的骨髓间充质干细胞由尾静脉注入受试鼠体内，同时制作皮肤缺损创伤模型，第1、2、3、4周处死受试鼠，经免疫荧光检测可见：经5-BrdU标记的骨髓来源的间充质干细胞在创面边缘和创伤局部的聚集(见免疫荧光照片)，而受试鼠正常皮肤组织未见该细胞的明显聚集现象，仅见5－BrdU标记的骨髓间充质干细胞的散在分布，此结果初步证实经尾静脉注入的骨髓间充质干细胞参与了创面愈合。基于此，我们将进一步研究骨髓来源的间充质干细胞在创面愈合过程中的迁移、增殖、分化情况，以期完善对创面愈合机制的认识，也为促进新的治疗手段和策略提供理论依据。
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。