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摘要：目的 制备阳春肾舒胶囊并建立其含量测定方法。方法 提取淫羊藿、牛膝、人参、黄芪和当归中的有效部位，经浓缩、干燥、粉碎后与蜂王浆冻干粉及鹿茸细粉混合均匀，制备阳春肾舒胶囊剂。建立采用高效液相色谱法（HPLC）测定阳春肾舒胶囊中淫羊藿和黄芪含量的方法，并进行方法学研究。结果 HPLC测定阳春肾舒胶囊中淫羊藿和黄芪的含量，方法专属性强、灵敏度和精密度高、阴性对照无干扰，重复性、稳定性、回收率均良好。结论 HPLC可用于有效控制阳春肾舒胶囊剂的质量。
关键词：阳春肾舒胶囊；淫羊藿苷；黄芪甲苷；高效液相色谱法；含量测定
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）09-0061-03
阳春肾舒胶囊处方来源于济宁市皮肤病防治院临床经验方，由鹿茸、淫羊藿、牛膝、人参、黄芪、当归、蜂王浆冻干粉组成，功能温阳益肾，主治肾阳虚证。将该临床经验方制成胶囊剂，服用方便，患者顺应性好，能保持该方原有疗效。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对阳春肾舒胶囊中淫羊藿（淫羊藿苷）、黄芪（黄芪甲苷）进行含量测定，以有效控制该制剂的质量。
1 仪器与试药
DTQ500KG多功能提取浓缩机组（湖南金一帆制药机械有限公司），FA1004分析天平，SH-10型快速水分测定仪，SK1200H超声波清洗器，岛津LC-2010高效液相色谱仪，SPD-10AVP紫外检测器，Altech 2000ES蒸发光散射检测器。
鹿茸、淫羊藿、牛膝、人参、黄芪、当归、蜂王浆冻干粉，均由济宁邦尔中药饮片有限公司提供；淫羊藿苷对照品（批号110805-200606）、牛膝对照药材（批号121065-201004）、人参皂苷Rg1对照品（批号110703-201027）、黄芪甲苷对照品（批号110781-200613）、当归对照药材（批号120927-201014），均购自中国药品生物制品检定所。
2 方法与结果
2.1 处方组成
阳春肾舒胶囊处方组成（g/1 000粒）：鹿茸100 g，淫羊藿400 g，黄芪400 g，当归400 g，牛膝220 g，人参200 g，蜂王浆冻干粉20 g。
2.2 制备工艺
2.2.1 鹿茸细粉的制备 取鹿茸，低温真空干燥（70 ℃， -0.05 MPa，含水分≤5.0%），粉碎、过筛（120目），备用。
2.2.2 人参提取物的制备 取人参单独加水煎煮提取3次，第1次加饮片重量7倍量的水煎煮2 h，第2次加饮片重量6倍量的水煎煮1.5 h，第3次加饮片重量4倍量的水煎煮1 h，合并煎液，滤过，滤液备用。
2.2.3 淫羊藿、黄芪、当归、牛膝混合提取物的制备 取淫羊藿、黄芪、当归、牛膝加水煎煮提取3次，第1次加饮片重量6倍量的水煎煮2 h，第2次加饮片重量5倍量的水煎煮1.5 h，第3次加饮片重量3倍量的水煎煮1 h，合并煎液，滤过，滤液备用。
2.2.4 阳春肾舒胶囊的制备 将“2.2.2”和“2.2.3”项下的滤液合并，减压（-0.04 MPa）浓缩成相对密度为1.31～1.35的浸膏（60～65 ℃），加乙醇使含醇量达60%，充分搅匀，冷藏静置24 h，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，低温真空干燥（70 ℃，-0.05 MPa，含水分≤5.0%），粉碎、过筛（120目），加处方量的鹿茸细粉、蜂王浆冻干粉及适量淀粉，混匀，装入1号胶囊（每粒装0.37 g），即得。
2.3 淫羊藿苷的含量测定
2.3.1 色谱条件与系统适用性 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水（28∶72）为流动相；检测波长270 nm；流速1 mL/min，柱温35 ℃；理论塔板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3 000[1]。
2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品5.0 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得对照品贮备液。精密吸取贮备液适量，加甲醇制成25 ?g/mL的溶液，摇匀即得。
2.3.3 供试品溶液的制备 取本品内容物0.45 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70%乙醇50 mL，密塞，称重，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，取出，放冷，再称重，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续滤液，即得。
2.3.4 阴性对照溶液的制备 按阳春肾舒胶囊处方和制备工艺制备不含淫羊藿的阴性对照品，按“2.3.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.3.5 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定（见图1）。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱保留时间相同的位置上，显相同的最大吸收峰；而阴性对照溶液色谱中，在与对照品溶液色谱保留时间相同的位置上，未见明显吸收峰。结果表明阴性对照溶液对测定无明显干扰。
2.3.6 线性关系试验 精密吸取对照品贮备液适量，加甲醇制成浓度分别为10、20、40、60、80 ?g/mL的系列标准溶液。吸取上述溶液各10 ?L注入高效液相色谱仪，按上述测定条件及方法测得色谱峰面积积分值。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y=2 225 893.45X-13 881.50（r=0.999 6）。结果表明，淫羊藿苷的进样量在0.10～0.80 ?g范围内时，峰面积与进样量呈良好的线性关系。
2.3.7 精密度试验 精密吸取淫羊藿苷对照品溶液，按上述试验方法，每次进样10 ?L，连续进样5次，记录峰面积，求得RSD=0.74%。
2.3.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h各进样10 ?L，记录峰面积，求得RSD=0.81%。 2.3.9 重复性试验 取同一供试品，按“2.3.3”项下方法制备5份供试品溶液，分别进样10 ?L，记录峰面积，求得RSD=0.74%。
2.3.10 加样回收率试验 分别精密吸取已知淫羊藿苷含量的同一供试品溶液5份，置具塞瓶中，各精密加入上述对照品溶液适量摇匀，按上述测定条件及含量测定方法进行测定，计算回收率，结果见表1。淫羊藿苷平均回收率为99.36%，RSD=0.67%。
2.3.11 样品中淫羊藿苷的含量测定 取10批阳春肾舒胶囊样品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，进样10 ?L，记录峰面积，计算淫羊藿苷含量，10批样品含量平均值为2.97 mg/g，结果见表2。根据10批样品中淫羊藿苷（C33H40O15）的含量测定结果，制定本品淫羊藿含量标准：每粒含淫羊藿以淫羊藿苷（C33H40O15）计，不得少于1.0 mg。
2.4 黄芪甲苷的含量测定
2.4.1 色谱条件与系统适用性 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水（30∶70）为流动相，蒸发光散射检测器检测。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4 000[2]。
2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品8 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得对照品浓贮备液。精密吸取浓贮备液适量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。
2.4.3 供试品溶液的制备 取本品内容物4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水30 mL，超声处理（功率200 W，频率40 kHz） 30 min，取出，放冷，用水饱和的正丁醇振摇提取3次（40、30、20 mL），合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次30 mL，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4.4 阴性对照溶液的制备 按阳春肾舒胶囊处方和制备工艺制备不含黄芪的阴性对照样品，按“2.4.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.4.5 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定（见图2）。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱保留时间相同的位置上，显相同的最大吸收峰；而阴性对照溶液色谱中，在与对照品溶液色谱保留时间相同的位置上，未见明显吸收峰。结果表明阴性对照溶液对测定无明显干扰。
2.4.6 线性关系试验 精密吸取对照品贮备液适量，加甲醇制成浓度分别为80、160、320、480、640 ?g/mL的系列标准溶液。吸取上述溶液各10 ?L注入高效液相色谱仪，按上述测定条件及方法测得色谱峰面积积分值。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y=2.513 3×104X-1.342 2×103（r=0.998 4）。结果表明，黄芪甲苷的进样量在0.80～6.40 ?g范围内时，峰面积与进样量呈良好的线性关系。
2.4.7 精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液，按上述试验方法，每次进样10 ?L，连续进样5次，记录峰面积，求得RSD=0.45%。
2.4.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h各进样10 ?L，记录峰面积，求得RSD=0.38%。
2.4.9 重复性试验 取同一供试品，按“2.4.3”项下方法制备5份供试品溶液，分别进样10 ?L，记录峰面积，求得RSD=0.52%。
2.4.10 加样回收率试验 分别精密吸取已知黄芪甲苷含量的同一供试品溶液5份，置具塞瓶中，各精密加入上述对照品溶液适量摇匀，按上述测定条件及含量测定方法进行测定，计算回收率，结果见表3。黄芪甲苷平均回收率为98.80%，RSD=1.29%。
2.4.11 样品中黄芪甲苷的含量测定 取10批阳春肾舒胶囊样品，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，进样10 ?L，记录峰面积，用外标两点法对数方程计算黄芪甲苷含量，10样品含量平均值为0.28 mg/g，结果见表4。根据10批样品中黄芪甲苷（C41H68O14）的含量测定结果，制定本品黄芪含量标准为：每粒含黄芪以黄芪甲苷（C41H68O14）计，不得少于0.09 mg。
3 结论
本研究制剂配制过程不会使原组方中治疗疾病的物质基础发生变化，生产工艺可行，患者服用方便，使用顺应性好。采用HPLC测定阳春肾舒胶囊中淫羊藿苷、黄芪甲苷的含量，具有方法简便准确、精密度高，重复性、稳定性、回收率良好的特点，可以有效控制阳春肾舒胶囊的质量。
参考文献：
[1] 徐天玲.HPLC法测定强骨益肾胶囊中淫羊藿苷的含量[J].中国药师， 2010，13（10）：1526-1527.
[2] 杨海燕，徐长根，张倩倩，等.HPLC-ELSD测定痛宁片中黄芪甲苷的含量[J].中成药，2007，29（3）：467-468.
（收稿日期：2012-02-23，编辑：陈静）
关键词：阳春肾舒胶囊；淫羊藿苷；黄芪甲苷；高效液相色谱法；含量测定
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）09-0061-03
阳春肾舒胶囊处方来源于济宁市皮肤病防治院临床经验方，由鹿茸、淫羊藿、牛膝、人参、黄芪、当归、蜂王浆冻干粉组成，功能温阳益肾，主治肾阳虚证。将该临床经验方制成胶囊剂，服用方便，患者顺应性好，能保持该方原有疗效。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对阳春肾舒胶囊中淫羊藿（淫羊藿苷）、黄芪（黄芪甲苷）进行含量测定，以有效控制该制剂的质量。
1 仪器与试药
DTQ500KG多功能提取浓缩机组（湖南金一帆制药机械有限公司），FA1004分析天平，SH-10型快速水分测定仪，SK1200H超声波清洗器，岛津LC-2010高效液相色谱仪，SPD-10AVP紫外检测器，Altech 2000ES蒸发光散射检测器。
鹿茸、淫羊藿、牛膝、人参、黄芪、当归、蜂王浆冻干粉，均由济宁邦尔中药饮片有限公司提供；淫羊藿苷对照品（批号110805-200606）、牛膝对照药材（批号121065-201004）、人参皂苷Rg1对照品（批号110703-201027）、黄芪甲苷对照品（批号110781-200613）、当归对照药材（批号120927-201014），均购自中国药品生物制品检定所。
2 方法与结果
2.1 处方组成
阳春肾舒胶囊处方组成（g/1 000粒）：鹿茸100 g，淫羊藿400 g，黄芪400 g，当归400 g，牛膝220 g，人参200 g，蜂王浆冻干粉20 g。
2.2 制备工艺
2.2.1 鹿茸细粉的制备 取鹿茸，低温真空干燥（70 ℃， -0.05 MPa，含水分≤5.0%），粉碎、过筛（120目），备用。
2.2.2 人参提取物的制备 取人参单独加水煎煮提取3次，第1次加饮片重量7倍量的水煎煮2 h，第2次加饮片重量6倍量的水煎煮1.5 h，第3次加饮片重量4倍量的水煎煮1 h，合并煎液，滤过，滤液备用。
2.2.3 淫羊藿、黄芪、当归、牛膝混合提取物的制备 取淫羊藿、黄芪、当归、牛膝加水煎煮提取3次，第1次加饮片重量6倍量的水煎煮2 h，第2次加饮片重量5倍量的水煎煮1.5 h，第3次加饮片重量3倍量的水煎煮1 h，合并煎液，滤过，滤液备用。
2.2.4 阳春肾舒胶囊的制备 将“2.2.2”和“2.2.3”项下的滤液合并，减压（-0.04 MPa）浓缩成相对密度为1.31～1.35的浸膏（60～65 ℃），加乙醇使含醇量达60%，充分搅匀，冷藏静置24 h，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，低温真空干燥（70 ℃，-0.05 MPa，含水分≤5.0%），粉碎、过筛（120目），加处方量的鹿茸细粉、蜂王浆冻干粉及适量淀粉，混匀，装入1号胶囊（每粒装0.37 g），即得。
2.3 淫羊藿苷的含量测定
2.3.1 色谱条件与系统适用性 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水（28∶72）为流动相；检测波长270 nm；流速1 mL/min，柱温35 ℃；理论塔板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3 000[1]。
2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品5.0 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得对照品贮备液。精密吸取贮备液适量，加甲醇制成25 ?g/mL的溶液，摇匀即得。
2.3.3 供试品溶液的制备 取本品内容物0.45 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70%乙醇50 mL，密塞，称重，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，取出，放冷，再称重，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续滤液，即得。
2.3.4 阴性对照溶液的制备 按阳春肾舒胶囊处方和制备工艺制备不含淫羊藿的阴性对照品，按“2.3.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.3.5 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定（见图1）。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱保留时间相同的位置上，显相同的最大吸收峰；而阴性对照溶液色谱中，在与对照品溶液色谱保留时间相同的位置上，未见明显吸收峰。结果表明阴性对照溶液对测定无明显干扰。
2.3.6 线性关系试验 精密吸取对照品贮备液适量，加甲醇制成浓度分别为10、20、40、60、80 ?g/mL的系列标准溶液。吸取上述溶液各10 ?L注入高效液相色谱仪，按上述测定条件及方法测得色谱峰面积积分值。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y=2 225 893.45X-13 881.50（r=0.999 6）。结果表明，淫羊藿苷的进样量在0.10～0.80 ?g范围内时，峰面积与进样量呈良好的线性关系。
2.3.7 精密度试验 精密吸取淫羊藿苷对照品溶液，按上述试验方法，每次进样10 ?L，连续进样5次，记录峰面积，求得RSD=0.74%。
2.3.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h各进样10 ?L，记录峰面积，求得RSD=0.81%。 2.3.9 重复性试验 取同一供试品，按“2.3.3”项下方法制备5份供试品溶液，分别进样10 ?L，记录峰面积，求得RSD=0.74%。
2.3.10 加样回收率试验 分别精密吸取已知淫羊藿苷含量的同一供试品溶液5份，置具塞瓶中，各精密加入上述对照品溶液适量摇匀，按上述测定条件及含量测定方法进行测定，计算回收率，结果见表1。淫羊藿苷平均回收率为99.36%，RSD=0.67%。
2.3.11 样品中淫羊藿苷的含量测定 取10批阳春肾舒胶囊样品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，进样10 ?L，记录峰面积，计算淫羊藿苷含量，10批样品含量平均值为2.97 mg/g，结果见表2。根据10批样品中淫羊藿苷（C33H40O15）的含量测定结果，制定本品淫羊藿含量标准：每粒含淫羊藿以淫羊藿苷（C33H40O15）计，不得少于1.0 mg。
2.4 黄芪甲苷的含量测定
2.4.1 色谱条件与系统适用性 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水（30∶70）为流动相，蒸发光散射检测器检测。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4 000[2]。
2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品8 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得对照品浓贮备液。精密吸取浓贮备液适量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。
2.4.3 供试品溶液的制备 取本品内容物4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水30 mL，超声处理（功率200 W，频率40 kHz） 30 min，取出，放冷，用水饱和的正丁醇振摇提取3次（40、30、20 mL），合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次30 mL，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4.4 阴性对照溶液的制备 按阳春肾舒胶囊处方和制备工艺制备不含黄芪的阴性对照样品，按“2.4.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.4.5 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定（见图2）。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱保留时间相同的位置上，显相同的最大吸收峰；而阴性对照溶液色谱中，在与对照品溶液色谱保留时间相同的位置上，未见明显吸收峰。结果表明阴性对照溶液对测定无明显干扰。
2.4.6 线性关系试验 精密吸取对照品贮备液适量，加甲醇制成浓度分别为80、160、320、480、640 ?g/mL的系列标准溶液。吸取上述溶液各10 ?L注入高效液相色谱仪，按上述测定条件及方法测得色谱峰面积积分值。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y=2.513 3×104X-1.342 2×103（r=0.998 4）。结果表明，黄芪甲苷的进样量在0.80～6.40 ?g范围内时，峰面积与进样量呈良好的线性关系。
2.4.7 精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液，按上述试验方法，每次进样10 ?L，连续进样5次，记录峰面积，求得RSD=0.45%。
2.4.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h各进样10 ?L，记录峰面积，求得RSD=0.38%。
2.4.9 重复性试验 取同一供试品，按“2.4.3”项下方法制备5份供试品溶液，分别进样10 ?L，记录峰面积，求得RSD=0.52%。
2.4.10 加样回收率试验 分别精密吸取已知黄芪甲苷含量的同一供试品溶液5份，置具塞瓶中，各精密加入上述对照品溶液适量摇匀，按上述测定条件及含量测定方法进行测定，计算回收率，结果见表3。黄芪甲苷平均回收率为98.80%，RSD=1.29%。
2.4.11 样品中黄芪甲苷的含量测定 取10批阳春肾舒胶囊样品，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，进样10 ?L，记录峰面积，用外标两点法对数方程计算黄芪甲苷含量，10样品含量平均值为0.28 mg/g，结果见表4。根据10批样品中黄芪甲苷（C41H68O14）的含量测定结果，制定本品黄芪含量标准为：每粒含黄芪以黄芪甲苷（C41H68O14）计，不得少于0.09 mg。
3 结论
本研究制剂配制过程不会使原组方中治疗疾病的物质基础发生变化，生产工艺可行，患者服用方便，使用顺应性好。采用HPLC测定阳春肾舒胶囊中淫羊藿苷、黄芪甲苷的含量，具有方法简便准确、精密度高，重复性、稳定性、回收率良好的特点，可以有效控制阳春肾舒胶囊的质量。
参考文献：
[1] 徐天玲.HPLC法测定强骨益肾胶囊中淫羊藿苷的含量[J].中国药师， 2010，13（10）：1526-1527.
[2] 杨海燕，徐长根，张倩倩，等.HPLC-ELSD测定痛宁片中黄芪甲苷的含量[J].中成药，2007，29（3）：467-468.
（收稿日期：2012-02-23，编辑：陈静）