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[摘要]目的探讨BMSCs移植对AD模型大鼠的治疗作用。方法将大鼠随机分成5组，正常组、模型组、模型对照组、治疗组、治疗对照组，每组10只。双侧海马区注射Aβ建立AD大鼠模型后，治疗组进行BMSCs的移植治疗。治疗对照组用氢溴酸加兰他敏进行灌胃治疗。结果行为学实验检测各组大鼠平均逃避潜伏期及首次跨越原平台时间，模型组与正常组比较（P<0.01），治疗组与治疗对照组与模型组比较（P<0.01），与正常组比较（P<0.05），均有显著性差异；形态学实验HE染色显示模型组颗粒细胞及锥体细胞有破坏现象，治疗组和治疗对照组明显恢复。免疫组化检测显示正常组和模型对照组可见海马区阳性蛋白表达较多而模型组阳性表达明显减少，治疗组和治疗对照组阳性表达较模型组明显增多。结论BMSCs移植治疗AD的作用机制可能与通过调节Wnt信号转导通路，影响了学习记忆相关酶及蛋白在海马区的表达而发挥作用有关。
[关键词]Wnt/β-Catenin；骨髓基质干细胞；阿尔茨海默病
阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，AD）是一种中枢神经系统退行性疾病，其神经组织无法自然恢复。因此，体外诱导多能干细胞分化进行细胞移植来修复受损的神经组织已经成为研究的热点之一。近年来发现，Wnt信号通路控制着体内多种程序，例如细胞的增殖、自我更新、细胞分化、细胞极性、细胞死亡等过程。Wnt信号通路与AD的病理过程存在着十分密切的关系，同时在神经干细胞的增殖、分化以及迁移等方面也起着重要的作用。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchvmalstem cells，BMSCs）在中枢神经组织移植中有明显优势，是一种良好的细胞替代治疗的靶细胞。因此本研究希望通过观察Wnt通路相关蛋白β-Catenin的变化，探讨BMSCs移植对AD模型大鼠的治疗作用。
1材料与方法
1.1材料
清洁级健康Wistar雄性大鼠50只，体重180～220g，由吉林大学医学院提供；Moriss水迷宫；大鼠脑立体定位仪；Aβ美国Biosource公司；氢溴酸加兰他敏，陕西森弗生物技术有限公司；β-Catenin测试盒购自武汉众一生物试剂经营部。
1.2实验动物分组
健康Wistar大鼠雄性50只随机分成5组，正常组、模型组、模型对照组、治疗组、治疗对照组，每组10只。
1.3方法
正常组：常规饲养，不进行任何处理。模型组：称重，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，脑立体定位仪固定，暴露顶骨，根据大鼠脑立体定位仪图谱，选择大鼠海马区进行注射双侧海马区注射Aβ每侧10μL，5min内注完，注射后留针5min，术后用牙托粉封固骨孔，缝合皮肤，三日内每日肌注青霉素G10万单位。造模后7天，利用Moriss水迷宫进行试验，检测造模是否成功，成功后不进行任何治疗。模型对照组，注射生理盐水代替Aβ方法同模型组。治疗组：建立AD大鼠模型后，进行BMSCs的移植治疗，将培养好的BMSCs向AD模型大鼠双侧海马内注射，注射部位为原Aβ的注射部位，术后处理同模型组。治疗对照组：建立AD大鼠模型后，用氢溴酸加兰他敏，以每日每千克体重0.6mg灌胃，治疗30d。
1.4测定方法
1.4.1行为学实验在造模后7d及治疗30d后，进行Morris水迷宫实验：定位航行实验用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力。将大鼠进行水迷宫学习训练3d。记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间，即逃避潜伏期。空间探索实验用于测量大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力。定位航行实验结束后，即第4d开始撤去平台，将大鼠从同一个入水点放入水中，测验大鼠对原平台的记忆。记录其第一次到达原平台位置的时间。
1.4.2形态学实验各组大鼠行为学检测完毕，取脑组织海马进行石蜡切片制作并采用HE染色观察海马神经元的形态结构的改变。
1.4.3免疫组化染色
采用PV二步法进行免疫组化检测各组AD大鼠海马组织细胞中Wnt信号通路相关蛋白β-Catenin的表达，其中阴性对照组应用0.01MPB缓冲液代替一抗，显微镜观察。
1.5统计学处理
采用Image-Proplus5.0图像分析软件及SPSS17.0软件进行数据分析，进行t检验，计量资料以（x±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1行为学检测
定位航行实验和空间探索实验检测各组大鼠平均逃避潜伏期及首次跨越原平台时间。模型组大鼠逃避潜伏期及首次跨越平台时间均比正常组降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，治疗对照组及治疗组大鼠学习记忆能力有明显改善，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2形态学检测
各组大鼠行为学检测完毕，取脑组织海马进行石蜡切片制作并采用HE染色观察海马神经元的形态学改变。见图1。
A和B两图可见海马区颗粒细胞及锥体细胞呈多层规则排列，整齐而紧密。神经元内胞浆丰富，颗粒细胞核大而圆，染色质较浅，核膜清楚，可见清晰嗜碱性核仁；锥体细胞树突丰富，长而整齐地向海马伸展；c图颗粒细胞及锥体细胞有破坏现象，细胞排列稀疏、紊乱，细胞体积缩小，间隙扩大，出现胞浆浓缩深染和胞核固缩，锥体细胞树突变短，稀疏；D和E图海马区颗粒细胞排列较规整，细胞清晰，核圆，核仁明显，细胞数量减少。
2.3wnt信号通路相关蛋白β-Catenin的表达
A和B两图可见海马区阳性蛋白表达较多，可见较多棕黄色颗粒主要位于胞浆内；C图阳性表达明显减少；D和E图海马区阳性表达与C图比较明显增多，接近于A图和B图。见图2。
3讨论
AD是中枢神经系统退行性疾病，主要表现为学习记忆能力损害，是老年痴呆最常见的一种。脑内老年斑形成、含有tau蛋白的神经纤维缠结以及神经元缺失变性是其三大病理学特征。Wnt信号通路的激活能够阻止β-淀粉样蛋白引起的神经毒性对神经元的损害。此外，突触丢失诱导的神经元死亡也是AD发病的危险因素之一。如果突触组装与去组装行为发生失衡，那么便可能会引起神经退行性病变，激活Wnt信号通路能够通过促进突触发生而保护神经元。大量研究表明，Wnt信号通路参与了有功能的完整的神经元产生的大部分过程，故Wnt信号通路在AD的发生中起着重要的作用。Wnt蛋白通过自分泌或旁分泌作用与位于细胞膜上的受体相结合，激活细胞内信号通路，调节靶基因的表达，在胚胎的发育过程中对细胞的增殖、分化、迁移、极性化和凋亡均起到重要的作用。神经元死亡是神经退行性疾病如AD、帕金森病以及脑中风、脑外伤等最为重要的病理特征。研究发现，精神分裂症患者脑内Wnt信号通路失调，通路中的胞内β-Catenin含量明显减少。β-Catenin基因位于3p21，编码蛋白分子量约92kD，是Wnt信号通路中的重要一员，是正向调节因素。Wnt信号的传递取决于胞浆内游离β-catenin的水平。Wnt/β-Catenin信号途径对神经系统的发育、神经干细胞的增殖和分化都有着重要的作用，细胞内游离β-Catenin的水平能够影响-神经元树突的形态发生，同时，高水平的β-Catenin还可促进神经元树突的分枝。
BMSCs是存在于骨髓腔内的多能干细胞，具有独特的免疫学特征，是理想的组织工程种子细胞。因其来源广泛，取材方便，增殖能力强，并且具有多向分化能力，在特定的条件下能被诱导分化为骨、软骨、脂肪等中胚层细胞，所以被广泛应用于再生医学行列，在一些神经系统疾病如神经退行性疾病的治疗中发挥作用。Lee等发现，将BMSCs移植到AD大鼠海马的齿状回附近，细胞移植组的β-淀粉样蛋白水平下降，并且β-淀粉样蛋白沉积的减少伴随着小胶质细胞的激活，小胶质细胞常常出现在β-淀粉样蛋白沉积的附近，因此BMSCs具有清除β-淀粉样蛋白沉积和/或阻断β-淀粉样蛋白沉积形成的作用。
本研究发现，BMSCs移植治疗后，在AD模型大鼠的行为学、形态学以及免疫组化等检测方面，均有明显改变，符合上述研究发现。因此，深入阐明Wnt信号在干细胞中的精确功能，在干细胞增殖分化中的具体机制及其与AD的关系，对将来临床BMSCs治疗AD等神经系统退行性疾病方面具有非常重要的意义。
[关键词]Wnt/β-Catenin；骨髓基质干细胞；阿尔茨海默病
阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，AD）是一种中枢神经系统退行性疾病，其神经组织无法自然恢复。因此，体外诱导多能干细胞分化进行细胞移植来修复受损的神经组织已经成为研究的热点之一。近年来发现，Wnt信号通路控制着体内多种程序，例如细胞的增殖、自我更新、细胞分化、细胞极性、细胞死亡等过程。Wnt信号通路与AD的病理过程存在着十分密切的关系，同时在神经干细胞的增殖、分化以及迁移等方面也起着重要的作用。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchvmalstem cells，BMSCs）在中枢神经组织移植中有明显优势，是一种良好的细胞替代治疗的靶细胞。因此本研究希望通过观察Wnt通路相关蛋白β-Catenin的变化，探讨BMSCs移植对AD模型大鼠的治疗作用。
1材料与方法
1.1材料
清洁级健康Wistar雄性大鼠50只，体重180～220g，由吉林大学医学院提供；Moriss水迷宫；大鼠脑立体定位仪；Aβ美国Biosource公司；氢溴酸加兰他敏，陕西森弗生物技术有限公司；β-Catenin测试盒购自武汉众一生物试剂经营部。
1.2实验动物分组
健康Wistar大鼠雄性50只随机分成5组，正常组、模型组、模型对照组、治疗组、治疗对照组，每组10只。
1.3方法
正常组：常规饲养，不进行任何处理。模型组：称重，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，脑立体定位仪固定，暴露顶骨，根据大鼠脑立体定位仪图谱，选择大鼠海马区进行注射双侧海马区注射Aβ每侧10μL，5min内注完，注射后留针5min，术后用牙托粉封固骨孔，缝合皮肤，三日内每日肌注青霉素G10万单位。造模后7天，利用Moriss水迷宫进行试验，检测造模是否成功，成功后不进行任何治疗。模型对照组，注射生理盐水代替Aβ方法同模型组。治疗组：建立AD大鼠模型后，进行BMSCs的移植治疗，将培养好的BMSCs向AD模型大鼠双侧海马内注射，注射部位为原Aβ的注射部位，术后处理同模型组。治疗对照组：建立AD大鼠模型后，用氢溴酸加兰他敏，以每日每千克体重0.6mg灌胃，治疗30d。
1.4测定方法
1.4.1行为学实验在造模后7d及治疗30d后，进行Morris水迷宫实验：定位航行实验用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力。将大鼠进行水迷宫学习训练3d。记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间，即逃避潜伏期。空间探索实验用于测量大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力。定位航行实验结束后，即第4d开始撤去平台，将大鼠从同一个入水点放入水中，测验大鼠对原平台的记忆。记录其第一次到达原平台位置的时间。
1.4.2形态学实验各组大鼠行为学检测完毕，取脑组织海马进行石蜡切片制作并采用HE染色观察海马神经元的形态结构的改变。
1.4.3免疫组化染色
采用PV二步法进行免疫组化检测各组AD大鼠海马组织细胞中Wnt信号通路相关蛋白β-Catenin的表达，其中阴性对照组应用0.01MPB缓冲液代替一抗，显微镜观察。
1.5统计学处理
采用Image-Proplus5.0图像分析软件及SPSS17.0软件进行数据分析，进行t检验，计量资料以（x±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1行为学检测
定位航行实验和空间探索实验检测各组大鼠平均逃避潜伏期及首次跨越原平台时间。模型组大鼠逃避潜伏期及首次跨越平台时间均比正常组降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，治疗对照组及治疗组大鼠学习记忆能力有明显改善，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2形态学检测
各组大鼠行为学检测完毕，取脑组织海马进行石蜡切片制作并采用HE染色观察海马神经元的形态学改变。见图1。
A和B两图可见海马区颗粒细胞及锥体细胞呈多层规则排列，整齐而紧密。神经元内胞浆丰富，颗粒细胞核大而圆，染色质较浅，核膜清楚，可见清晰嗜碱性核仁；锥体细胞树突丰富，长而整齐地向海马伸展；c图颗粒细胞及锥体细胞有破坏现象，细胞排列稀疏、紊乱，细胞体积缩小，间隙扩大，出现胞浆浓缩深染和胞核固缩，锥体细胞树突变短，稀疏；D和E图海马区颗粒细胞排列较规整，细胞清晰，核圆，核仁明显，细胞数量减少。
2.3wnt信号通路相关蛋白β-Catenin的表达
A和B两图可见海马区阳性蛋白表达较多，可见较多棕黄色颗粒主要位于胞浆内；C图阳性表达明显减少；D和E图海马区阳性表达与C图比较明显增多，接近于A图和B图。见图2。
3讨论
AD是中枢神经系统退行性疾病，主要表现为学习记忆能力损害，是老年痴呆最常见的一种。脑内老年斑形成、含有tau蛋白的神经纤维缠结以及神经元缺失变性是其三大病理学特征。Wnt信号通路的激活能够阻止β-淀粉样蛋白引起的神经毒性对神经元的损害。此外，突触丢失诱导的神经元死亡也是AD发病的危险因素之一。如果突触组装与去组装行为发生失衡，那么便可能会引起神经退行性病变，激活Wnt信号通路能够通过促进突触发生而保护神经元。大量研究表明，Wnt信号通路参与了有功能的完整的神经元产生的大部分过程，故Wnt信号通路在AD的发生中起着重要的作用。Wnt蛋白通过自分泌或旁分泌作用与位于细胞膜上的受体相结合，激活细胞内信号通路，调节靶基因的表达，在胚胎的发育过程中对细胞的增殖、分化、迁移、极性化和凋亡均起到重要的作用。神经元死亡是神经退行性疾病如AD、帕金森病以及脑中风、脑外伤等最为重要的病理特征。研究发现，精神分裂症患者脑内Wnt信号通路失调，通路中的胞内β-Catenin含量明显减少。β-Catenin基因位于3p21，编码蛋白分子量约92kD，是Wnt信号通路中的重要一员，是正向调节因素。Wnt信号的传递取决于胞浆内游离β-catenin的水平。Wnt/β-Catenin信号途径对神经系统的发育、神经干细胞的增殖和分化都有着重要的作用，细胞内游离β-Catenin的水平能够影响-神经元树突的形态发生，同时，高水平的β-Catenin还可促进神经元树突的分枝。
BMSCs是存在于骨髓腔内的多能干细胞，具有独特的免疫学特征，是理想的组织工程种子细胞。因其来源广泛，取材方便，增殖能力强，并且具有多向分化能力，在特定的条件下能被诱导分化为骨、软骨、脂肪等中胚层细胞，所以被广泛应用于再生医学行列，在一些神经系统疾病如神经退行性疾病的治疗中发挥作用。Lee等发现，将BMSCs移植到AD大鼠海马的齿状回附近，细胞移植组的β-淀粉样蛋白水平下降，并且β-淀粉样蛋白沉积的减少伴随着小胶质细胞的激活，小胶质细胞常常出现在β-淀粉样蛋白沉积的附近，因此BMSCs具有清除β-淀粉样蛋白沉积和/或阻断β-淀粉样蛋白沉积形成的作用。
本研究发现，BMSCs移植治疗后，在AD模型大鼠的行为学、形态学以及免疫组化等检测方面，均有明显改变，符合上述研究发现。因此，深入阐明Wnt信号在干细胞中的精确功能，在干细胞增殖分化中的具体机制及其与AD的关系，对将来临床BMSCs治疗AD等神经系统退行性疾病方面具有非常重要的意义。