论文部分内容阅读
摘要：目的 筛选出骨肉瘤中关键基因，并进一步分析其调控miRNA，分析其可能的机制及临床意义。方法 采用的R语言limma软件包对miRNA芯片进行差异分析，并利用生物信息学数据库预测可能结合调控的miRNA。最终利用R语言Upset取各数据库预测到的miRNA和差异性表达的miRNA得到的交集作为关键miRNA。结果 生物信息学分析结果发现EFNA1在骨肉瘤对比成骨细胞组中显著高表达。进一步七个不同的数据库预测EFNA1的上游调控miRNA，得到唯一的交集为hsa-miR-1915-3p。结论 EFNA1的高表达会促进骨肉瘤的发展，而hsa-miR-1915-3p可能是EFNA1的潜在调控靶点。
【中图分类号】R730.4 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）08-018-01
人骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤之一，其发病率，死亡率较高和易发现转移[1]。 尽管在过去几十年中，针对OS的治疗策略取得了重大进展，但由于诊断和转移的发展延迟，其预后仍然很差[2]。因此，需要寻找新的生物标志物，并确保骨肉瘤患者的有效治疗。近几十年来，研究发现了一类新的非编码RNA （ncRNA），如microRNAs （miRNAs）等非编码RNA[3]。它们都具有不同的调节功能，有效地调节细胞功能的基本蛋白效应器，并在骨肉瘤的发展和进展中发挥重要作用。其中miRNA是非编码基因中重要的家族，在肿瘤的发生和OS的发展中发挥着关键的作用[4]因此，本文中我们主要探讨筛选出关键的靶基因，并进一步预测其可能调控的miRNA进行生物信息学分析，为骨肉瘤的分子标志物和临床治疗提供新的视角。
1.方法
1.1数据收集
登录 GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） ，找出已经公布的骨肉瘤基因芯片数据集GSE14359（平台为：GPL96 [HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array）。对芯片进行整理，共获得20个数据集，18个为骨肉瘤细胞系数据，2个为非肿瘤性成骨细胞的原代细胞数据。TARGET数据库（https//ocg.cancer.gov/programs/target）是一个儿童肿瘤数据库，从其中下载得到86例具有完整临床生存信息的表达谱和临床信息。GEO与TARGET均为公开的数据库，所以不需要道德委员会批准。
1.2差异分析
利用R语言软件包“limma”，对数据进行对比差异分析筛选差异基因。筛选条件为P<0.05，|log2（FoldChange）|>1，随后得到的差异基因使用火山图进行展示。
1.3差异基因KEGG通路富集
利用R语言软件包“clusterProfiler”，对得到的差异基因进行KEGG通路富集分析。利用R软件包“org.Hs.eg.db”，“enrichplot”，“ggplot2 “等对基因进行注释，制作气泡图进行展示。
1.4生存分析
对KEGG通路富集分析中最富集的通路基因，利用TARGET构建的生存模型进行生存分析。生存分析分组基于对单基因的表达，以中位数作为分组依据分成高表达组和低表达组。
1.5基因预测可能潜在结合的miRNA
利用miRWalk（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/index.html），Microt4，miRanda，mirbridge，miRMap，RNAhybrid，Targetscan七个预测数据库对筛选出的关键基因进行预测可能结合miRNA。利用R软件包“UpSet”对七个数据库预测到的miRNAs进行取交集。
2.结果
2.1筛选差异基因
如图1所示，结果差异基因分析，共得到差异基因848个，其中上调差异基因514，下调基因334个。
2.2KEGG通路富集分析
利用差异分析得到的848个差异基因进行KEGG通路富集分析，结果如图2中A所示。KEGG富集分析结果显示，最富集的通路是PI3K-Akt信号通路，共有35个基因富集于此。
2.3生存分析
利用TARGET构建的生存模型对富集于PI3K-Akt信号通路的35个基因进行生存分析，结果显示仅只有一个基因具有显著性意义（P<0.05）。如图2中B显示，EFNA1基因表达分成高低两组，其中高表达组的预后不良，并且EFNA1屬于上调差异基因。
2.4靶基因预测调控miRNA
通过七个不同的数据库对EFNA1，进行预测可能发生结合的miRNA，并且取七者的交集得到一个唯一的miRNA是has-miR-1915-3p，如图2中C所示。
3.讨论
近些年来，随着高通量测序技术的不断发展，生物信息学被广泛应用于揭示多种癌症的基因组水平的肿瘤进展和癌变的内在机制[5]。值得关注的是有许多生物信息学网络工具可以帮助我们分析相关数据，并提供标准化和可视化的结果。现阶段，骨肉瘤的微阵列数据仍然有限，但可以发现一些隐藏的、有趣的信息，如骨肉瘤关键基因的表达[6]、骨肉瘤中的miRNA[7]。
在本研究中，我们从公开的表达谱数据中鉴定了差异表达的mRNA，并对差异基因进行KEGG通路富集分析。PI3K-Akt信号通路被认为是人类癌症中最重要的致癌途径之一，同时影响着骨肉瘤细胞的凋亡等进程[8，9]。根据TARGET数据库确定了预后相关的差异基因为EFNA1。最近，有研究通过生物信息学分析发现EFNA1在乳腺癌对比癌旁中的高表达于乳腺癌，并对预后有影响[10]。有研究表明，EphA2 /EFNA1高表达于肝癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、胃腺癌、脑胶质瘤、膀胱癌、成骨肉瘤及恶性黑色素瘤等[11] 20种细胞系中，这于我们的分析结果所一致。 随后，进一步预测了可能结合的miRNA发现has-miR-1915-3p可能與EFNA1结合。肺癌细胞中 miR-1915-3p 的过度表达可防止细胞的凋亡[12]。不过在另外一项研究中发现，与健康志愿者相比，miR-1915-3p的血清水平被调高，乳腺癌患者的血清水平显著下降[10]。这两者之间有不同的结果，遗憾的是还未见has-miR-1915-3p在骨肉瘤中的表达是否升高的研究报道，因此有待进一步研究。总而言之，本研究的发现可能为骨肉瘤的发病机制提供新的见解，并提出了值得进一步研究的潜在治疗靶点。
参考文献：
[1] Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004： data from the Surveillance， Epidemiology， and End Results Program - PubMed[EB/OL]. [2021-04-12]. https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19197972/.
[2] SIEGEL R L， MILLER K D， JEMAL A. Cancer statistics， 2018[J]. CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2018， 68（1）： 7–30.
[3] JONES K B， SALAH Z， DEL MARE S， 等. miRNA signatures associate with pathogenesis and progression of osteosarcoma[J]. Cancer Research， 2012， 72（7）： 1865–1877.
[4] ZHANG J， YAN Y-G， WANG C， 等. MicroRNAs in osteosarcoma[J]. Clinica Chimica Acta， 2015， 444： 9–17.
[5] LI M， JIN X， LI H， 等. Key genes with prognostic values in suppression of osteosarcoma metastasis using comprehensive analysis[J]. BMC Cancer， 2020， 20（1）： 65.
[6] LI M， JIN X， GUO F， 等. Integrative analyses of key genes and regulatory elements in fluoride-affected osteosarcoma[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2019， 120（9）： 15397–15409.
[7] Construction of microRNA-messenger networks for human osteosarcoma - PubMed[EB/OL]. [2021-06-09]. https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30666640/.
[8] ZHANG J， YU X-H， YAN Y-G， 等. PI3K/Akt signaling in osteosarcoma[J]. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry， 2015， 444： 182–192.
[9] ZHANG H， JIANG H， ZHANG H， 等. Anti-tumor efficacy of phellamurin in osteosarcoma cells： Involvement of the PI3K/AKT/mTOR pathway[J]. European Journal of Pharmacology， 2019， 858： 172477.
[10] GUO J， LIU C， WANG W， 等. Identification of serum miR-1915-3p and miR-455-3p as biomarkers for breast cancer[J]. PloS One， 2018， 13（7）： e0200716.
[11] 赵瑞皎， 吴向华， 石必枝， 等. 酪氨酸蛋白激酶受体EphA2及其配体EFNA1在23种肿瘤细胞系中的表达及其意义[J]. 中国癌症杂志， 2007（04）： 320–323.
[12] XU C， LI H， ZHANG L， 等. MicroRNA?1915?3p prevents the apoptosis of lung cancer cells by downregulating DRG2 and PBX2[J]. Molecular Medicine Reports， 2016， 13（1）： 505–512.
基金项目：广西研究生教育创新计划项目（编号：YCSW2021138）;
【中图分类号】R730.4 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）08-018-01
人骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤之一，其发病率，死亡率较高和易发现转移[1]。 尽管在过去几十年中，针对OS的治疗策略取得了重大进展，但由于诊断和转移的发展延迟，其预后仍然很差[2]。因此，需要寻找新的生物标志物，并确保骨肉瘤患者的有效治疗。近几十年来，研究发现了一类新的非编码RNA （ncRNA），如microRNAs （miRNAs）等非编码RNA[3]。它们都具有不同的调节功能，有效地调节细胞功能的基本蛋白效应器，并在骨肉瘤的发展和进展中发挥重要作用。其中miRNA是非编码基因中重要的家族，在肿瘤的发生和OS的发展中发挥着关键的作用[4]因此，本文中我们主要探讨筛选出关键的靶基因，并进一步预测其可能调控的miRNA进行生物信息学分析，为骨肉瘤的分子标志物和临床治疗提供新的视角。
1.方法
1.1数据收集
登录 GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） ，找出已经公布的骨肉瘤基因芯片数据集GSE14359（平台为：GPL96 [HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array）。对芯片进行整理，共获得20个数据集，18个为骨肉瘤细胞系数据，2个为非肿瘤性成骨细胞的原代细胞数据。TARGET数据库（https//ocg.cancer.gov/programs/target）是一个儿童肿瘤数据库，从其中下载得到86例具有完整临床生存信息的表达谱和临床信息。GEO与TARGET均为公开的数据库，所以不需要道德委员会批准。
1.2差异分析
利用R语言软件包“limma”，对数据进行对比差异分析筛选差异基因。筛选条件为P<0.05，|log2（FoldChange）|>1，随后得到的差异基因使用火山图进行展示。
1.3差异基因KEGG通路富集
利用R语言软件包“clusterProfiler”，对得到的差异基因进行KEGG通路富集分析。利用R软件包“org.Hs.eg.db”，“enrichplot”，“ggplot2 “等对基因进行注释，制作气泡图进行展示。
1.4生存分析
对KEGG通路富集分析中最富集的通路基因，利用TARGET构建的生存模型进行生存分析。生存分析分组基于对单基因的表达，以中位数作为分组依据分成高表达组和低表达组。
1.5基因预测可能潜在结合的miRNA
利用miRWalk（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/index.html），Microt4，miRanda，mirbridge，miRMap，RNAhybrid，Targetscan七个预测数据库对筛选出的关键基因进行预测可能结合miRNA。利用R软件包“UpSet”对七个数据库预测到的miRNAs进行取交集。
2.结果
2.1筛选差异基因
如图1所示，结果差异基因分析，共得到差异基因848个，其中上调差异基因514，下调基因334个。
2.2KEGG通路富集分析
利用差异分析得到的848个差异基因进行KEGG通路富集分析，结果如图2中A所示。KEGG富集分析结果显示，最富集的通路是PI3K-Akt信号通路，共有35个基因富集于此。
2.3生存分析
利用TARGET构建的生存模型对富集于PI3K-Akt信号通路的35个基因进行生存分析，结果显示仅只有一个基因具有显著性意义（P<0.05）。如图2中B显示，EFNA1基因表达分成高低两组，其中高表达组的预后不良，并且EFNA1屬于上调差异基因。
2.4靶基因预测调控miRNA
通过七个不同的数据库对EFNA1，进行预测可能发生结合的miRNA，并且取七者的交集得到一个唯一的miRNA是has-miR-1915-3p，如图2中C所示。
3.讨论
近些年来，随着高通量测序技术的不断发展，生物信息学被广泛应用于揭示多种癌症的基因组水平的肿瘤进展和癌变的内在机制[5]。值得关注的是有许多生物信息学网络工具可以帮助我们分析相关数据，并提供标准化和可视化的结果。现阶段，骨肉瘤的微阵列数据仍然有限，但可以发现一些隐藏的、有趣的信息，如骨肉瘤关键基因的表达[6]、骨肉瘤中的miRNA[7]。
在本研究中，我们从公开的表达谱数据中鉴定了差异表达的mRNA，并对差异基因进行KEGG通路富集分析。PI3K-Akt信号通路被认为是人类癌症中最重要的致癌途径之一，同时影响着骨肉瘤细胞的凋亡等进程[8，9]。根据TARGET数据库确定了预后相关的差异基因为EFNA1。最近，有研究通过生物信息学分析发现EFNA1在乳腺癌对比癌旁中的高表达于乳腺癌，并对预后有影响[10]。有研究表明，EphA2 /EFNA1高表达于肝癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、胃腺癌、脑胶质瘤、膀胱癌、成骨肉瘤及恶性黑色素瘤等[11] 20种细胞系中，这于我们的分析结果所一致。 随后，进一步预测了可能结合的miRNA发现has-miR-1915-3p可能與EFNA1结合。肺癌细胞中 miR-1915-3p 的过度表达可防止细胞的凋亡[12]。不过在另外一项研究中发现，与健康志愿者相比，miR-1915-3p的血清水平被调高，乳腺癌患者的血清水平显著下降[10]。这两者之间有不同的结果，遗憾的是还未见has-miR-1915-3p在骨肉瘤中的表达是否升高的研究报道，因此有待进一步研究。总而言之，本研究的发现可能为骨肉瘤的发病机制提供新的见解，并提出了值得进一步研究的潜在治疗靶点。
参考文献：
[1] Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004： data from the Surveillance， Epidemiology， and End Results Program - PubMed[EB/OL]. [2021-04-12]. https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19197972/.
[2] SIEGEL R L， MILLER K D， JEMAL A. Cancer statistics， 2018[J]. CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2018， 68（1）： 7–30.
[3] JONES K B， SALAH Z， DEL MARE S， 等. miRNA signatures associate with pathogenesis and progression of osteosarcoma[J]. Cancer Research， 2012， 72（7）： 1865–1877.
[4] ZHANG J， YAN Y-G， WANG C， 等. MicroRNAs in osteosarcoma[J]. Clinica Chimica Acta， 2015， 444： 9–17.
[5] LI M， JIN X， LI H， 等. Key genes with prognostic values in suppression of osteosarcoma metastasis using comprehensive analysis[J]. BMC Cancer， 2020， 20（1）： 65.
[6] LI M， JIN X， GUO F， 等. Integrative analyses of key genes and regulatory elements in fluoride-affected osteosarcoma[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2019， 120（9）： 15397–15409.
[7] Construction of microRNA-messenger networks for human osteosarcoma - PubMed[EB/OL]. [2021-06-09]. https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30666640/.
[8] ZHANG J， YU X-H， YAN Y-G， 等. PI3K/Akt signaling in osteosarcoma[J]. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry， 2015， 444： 182–192.
[9] ZHANG H， JIANG H， ZHANG H， 等. Anti-tumor efficacy of phellamurin in osteosarcoma cells： Involvement of the PI3K/AKT/mTOR pathway[J]. European Journal of Pharmacology， 2019， 858： 172477.
[10] GUO J， LIU C， WANG W， 等. Identification of serum miR-1915-3p and miR-455-3p as biomarkers for breast cancer[J]. PloS One， 2018， 13（7）： e0200716.
[11] 赵瑞皎， 吴向华， 石必枝， 等. 酪氨酸蛋白激酶受体EphA2及其配体EFNA1在23种肿瘤细胞系中的表达及其意义[J]. 中国癌症杂志， 2007（04）： 320–323.
[12] XU C， LI H， ZHANG L， 等. MicroRNA?1915?3p prevents the apoptosis of lung cancer cells by downregulating DRG2 and PBX2[J]. Molecular Medicine Reports， 2016， 13（1）： 505–512.
基金项目：广西研究生教育创新计划项目（编号：YCSW2021138）;