论文部分内容阅读
【摘要】 目的：探讨大肠癌组织VEGF、Ki-67的表达和微血管密度（MVD）及其临床意义。方法：应用免疫组化SP法检测60例大肠癌组织中VEGF、Ki-67的表达和MVD，并分析其临床特征及相关性。结果：大肠癌VEGF、Ki-67的阳性表达率分别为76.7%、73.2%，明显高于癌旁肠组织的35.0%、20.1%。两者比较差异均有统计学意义（P<0.05）；VEGF阳性率在有/无淋巴结转移的大肠癌中差异显著（P<0.05）；VEGF阳性表达组MVD值显著高于阴性组（P<0.05）。结论：VEGF与大肠癌的发生、发展和转移密切相关，提示阻断VEGF通路将对大肠癌的治疗提供新的靶点。Ki-67是肿瘤良恶性鉴别、提示预后的重要指标。
【关键词】 大肠肿瘤； 血管内皮生长因子； 微血管密度； Ki-67
实体肿瘤的生长侵袭与转移依赖于新生血管的生成。对肿瘤血管生成机制的研究，目前主要集中于VEGF家族和具有调节血管生成作用的酪氨酸激酶受体[1]。所有促血管生成因子中，VEGF在血管生成过程中起着关键性作用。本研究应用免疫组化方法检测大肠癌组织及癌旁组织中VEGF、Ki-67的表达，并探讨VEGF表达与CD34计数的微血管密度（MVD）的关系，从而评价VEGF在大肠癌发生、发展中的作用。同时观察Ki-67在肿瘤及瘤旁组织中的表达及意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集安阳市第六人民医院和安阳市第二人民医院2009-2011年资料完整的60例大肠癌根治术标本，患者术前均未经过任何抗肿瘤治疗。其中男42例，女18例，中位年龄52岁；有淋巴结转移者33例，无淋巴結转移者27例。大肠癌按WHO（2005）分型及有/无淋巴结转移进行分组。另选取大肠癌癌旁组织20例作为对照组。
1.2 研究方法 全部标本经4%中性甲醛液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，HE染色。免疫组化采用SP法。鼠抗人单克隆抗体VEGF、鼠抗人单克隆抗体CD34、鼠抗人单克隆抗体Ki-67及免疫组化试剂盒均购自福建迈新生物技术开发有限公司。以同一条件下染色的阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判定 VEGF、CD34定位于细胞质，以出现棕黄色颗粒为阳性细胞。阳性细胞数>10%为（+）。CD34阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇被视为血管。先低倍镜下全面观察切片以选择肿瘤内4个血管着色最密集的区域，在200倍镜下用网格状目镜测微尺计数染成棕色的血管数目，取4个视野的均值作为MVD值。Ki-67以肿瘤细胞核出现明显的棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞数1%～20%为（+），21%～50%为（++），>50%为（+++）。
1.4 统计学处理 应用SPSS 10.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 VEGF的表达与临床病理参数的关系 VEGF在癌组织中的阳性表达率为76.7%（46/60），明显高于癌旁组织中的35.0%（7/20），两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。VEGF在有淋巴结转移组和无淋巴结转移组中的阳性表达率也不同，分别为87.9%（29/33）和63.0%（17/27），两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。在癌组织中，VEGF阳性细胞弥漫并多聚集成团。从整体看，癌旁肠组织中VEGF阳性反应强度和范围较癌组织明显减弱。VEGF表达与癌细胞的胞质呈弥漫颗粒状，见图1。
2.2 Ki-67与临床病理参数的关系 Ki-67在大肠癌组织中的阳性表达率为73.2%明显高于癌旁肠组织的20.1%，两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。Ki-67阳性表达与有/无淋巴结转移无关（P>0.05）。Ki-67表达与癌细胞的胞核见图2。
2.3 VEGF阳性与MVD的相关性 46例大肠癌VEGF阳性表达组的MVD值为（38.32±12.65），14例VEGF阴性表达组为（29.63±9.3），两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。CD34定位于血管内皮细胞质，见图3。
3 讨论
肿瘤新生血管的生成过程中，VEGF被认为是最重要的促发因子，并与创伤愈合等生理性的新生血管形成有关。研究表明，VEGF具有促进内皮细胞分裂增殖，诱导毛细血管生芽、增加微血管通透性、促进内皮细胞迁移和抑制凋亡等多种作用[2]。VEGF-A可与VEGFR-1及VEGFR-2结合，但主要通过与VEGF-2结合发挥促血管生成作用[3]，缺氧引起细胞缺氧诱导因子1α和2α过表达，继而活化VEGF基因转录。同时突变的K-ras等癌基因、肿瘤抑制基因、一些生长因子及细胞因子等诱导VEGF的表达与分泌。本组研究显示，VEGF在大肠癌中的表达显著高于相应癌旁组织的表达（P<0.01）；VEGF阳性表达在有/无淋巴结转移的大肠癌中有显著差异（P<0.05），提示VEGF在大肠癌的发生、发展、转移过程中起重要作用。在肺癌患者组织和血浆中亦被证明VEGF表达水平显著升高[4-5]，且分期越晚血浆VEGF水平升高越明显。急性白血病患者血液中的VEGF含量明显升高，初始发病者较缓解组升高有统计学意义[6]，证明VEGF含量与病情的临床变化有关，对了解病情、判断预后有帮助。
肿瘤的生长过程有两个显著阶段，即从无血管的血管前期缓慢生长阶段转变为有血管的血管期快速增殖阶段。随着肿瘤性血管的增生肿瘤加速生长，血管为肿瘤生长提供营养。实验证明，肿瘤在无血管时呈线性生长，在血管生长时呈指数生长[7]。目前，MVD检测方法已成为定量分析肿瘤血管生成的金指标。MVD是一个独立而重要的预后因素，高MVD提示肿瘤易发生转移，预后不良[8]。血管亦为肿瘤转移提供重要的途径，有血道远处转移的患者预后往往较差。多数研究表明，VEGF的表达水平与MVD相关[9]，本组研究中VEGF阳性表达组MVD值显著高于VEGF阴性组（P<0.05），提示VEGF在大肠癌中可诱导微血管形成。 增殖能力的活跃程度是恶性肿瘤的重要标志之一，判断肿瘤的增殖能力是鉴别肿瘤的良恶性、提示肿瘤预后的重要指标。相较于高倍镜下进行核分裂计数，稳定的肿瘤增殖标记分子在免疫组化中的应用被认为是判断肿瘤增殖能力的可靠技术。Ki-67为细胞增生指数，是目前公认的稳定的肿瘤增殖标记分子[10-11]。本組研究中，Ki-67在大肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P<0.05），提示Ki-67可用于大肠癌的诊断和肿瘤发生的研究。
综上所述，大肠癌组织中VEGF、Ki-67的表达明显高于癌旁肠组织，且VEGF的表达与有/无淋巴结转移和MVD相关，表明VEGF在肿瘤血管形成、肿瘤发展、转移中扮演重要角色。VEGF及其受体是抗血管生成靶向治疗的主要靶标，VEGF检测对以VEGF为作用靶点的抗血管生成治疗具有明显的指导意义。
参考文献
[1]郭振英，曹伯良.血管内皮生长因子及相关促肿瘤血管生成分子及靶向治疗[J].中华病理学杂志，2010，39（4）：282-285.
[2] Roy H，Bhardwaj S，Yl?-Herttuala S.Biology of vascular endothelial growth factors[J].FEBS Lett，2006，580（12）：2879-2887.
[3] Yamazaki Y，Morita T.Molecular and functional diversity of vascular endothelial growth factors[J].Mol Divers，2006，10（4）：515-527.
[4]甄雪，裴毅.肺癌化疗后血浆VEGF水平与CEA变化的相关性[J].中国医学创新，2013，10（5）：15-16.
[5]吴健波，刁力，阎其涛，等.血管内皮生长因子-C与基质金属蛋白酶-2在肺腺癌中表达的研究[J].中国医学创新，2011，8（12）：13-15.
[6]罗伟，冀林华，李占全，等.急性白血病患者血浆VEGF测定及其临床意义[J].中国医学创新，2013，10（14）：70-71.
[7] Dalal S，Berry A M，Cullinane C J，et al.Vascular endothelial growth factors： a therapeutic target for tumors of the Ewing’s sarcoma family[J].Clin Cancer Res，2005，11（6）：2364-2378.
[8]丁洪基.肿瘤微血管密度检测及其临床病理意义[J].诊断病理学杂志，2008，15（3）：241-243.
[9] Perrone G，Vincenzi B，Santini D，et al.Correlation of p53 and bcl-2 expression with vascular endothelial growth factor（VEGF）， microvessel density（MVD） and clinico-pathological features in colon cancer[J].Cancer Lett，2004，208（2）：227-234.
[10]苏静，郑杰.肿瘤增殖标记分子Ki-67和增殖细胞核抗原及其在病理诊断中的应用[J].中华病理学杂志，2009，38（8）：568-571.
[11] Sandler A，Gray R，Perry M C，et al.Paclitaxel-carboplatin alone or with bevacizumab for non-small-cell lung cancer[J].N Engl J Med，2006，355（24）：2542-2550.
（收稿日期：2013-11-01） （本文编辑：蔡元元）
【关键词】 大肠肿瘤； 血管内皮生长因子； 微血管密度； Ki-67
实体肿瘤的生长侵袭与转移依赖于新生血管的生成。对肿瘤血管生成机制的研究，目前主要集中于VEGF家族和具有调节血管生成作用的酪氨酸激酶受体[1]。所有促血管生成因子中，VEGF在血管生成过程中起着关键性作用。本研究应用免疫组化方法检测大肠癌组织及癌旁组织中VEGF、Ki-67的表达，并探讨VEGF表达与CD34计数的微血管密度（MVD）的关系，从而评价VEGF在大肠癌发生、发展中的作用。同时观察Ki-67在肿瘤及瘤旁组织中的表达及意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集安阳市第六人民医院和安阳市第二人民医院2009-2011年资料完整的60例大肠癌根治术标本，患者术前均未经过任何抗肿瘤治疗。其中男42例，女18例，中位年龄52岁；有淋巴结转移者33例，无淋巴結转移者27例。大肠癌按WHO（2005）分型及有/无淋巴结转移进行分组。另选取大肠癌癌旁组织20例作为对照组。
1.2 研究方法 全部标本经4%中性甲醛液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，HE染色。免疫组化采用SP法。鼠抗人单克隆抗体VEGF、鼠抗人单克隆抗体CD34、鼠抗人单克隆抗体Ki-67及免疫组化试剂盒均购自福建迈新生物技术开发有限公司。以同一条件下染色的阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判定 VEGF、CD34定位于细胞质，以出现棕黄色颗粒为阳性细胞。阳性细胞数>10%为（+）。CD34阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇被视为血管。先低倍镜下全面观察切片以选择肿瘤内4个血管着色最密集的区域，在200倍镜下用网格状目镜测微尺计数染成棕色的血管数目，取4个视野的均值作为MVD值。Ki-67以肿瘤细胞核出现明显的棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞数1%～20%为（+），21%～50%为（++），>50%为（+++）。
1.4 统计学处理 应用SPSS 10.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 VEGF的表达与临床病理参数的关系 VEGF在癌组织中的阳性表达率为76.7%（46/60），明显高于癌旁组织中的35.0%（7/20），两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。VEGF在有淋巴结转移组和无淋巴结转移组中的阳性表达率也不同，分别为87.9%（29/33）和63.0%（17/27），两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。在癌组织中，VEGF阳性细胞弥漫并多聚集成团。从整体看，癌旁肠组织中VEGF阳性反应强度和范围较癌组织明显减弱。VEGF表达与癌细胞的胞质呈弥漫颗粒状，见图1。
2.2 Ki-67与临床病理参数的关系 Ki-67在大肠癌组织中的阳性表达率为73.2%明显高于癌旁肠组织的20.1%，两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。Ki-67阳性表达与有/无淋巴结转移无关（P>0.05）。Ki-67表达与癌细胞的胞核见图2。
2.3 VEGF阳性与MVD的相关性 46例大肠癌VEGF阳性表达组的MVD值为（38.32±12.65），14例VEGF阴性表达组为（29.63±9.3），两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。CD34定位于血管内皮细胞质，见图3。
3 讨论
肿瘤新生血管的生成过程中，VEGF被认为是最重要的促发因子，并与创伤愈合等生理性的新生血管形成有关。研究表明，VEGF具有促进内皮细胞分裂增殖，诱导毛细血管生芽、增加微血管通透性、促进内皮细胞迁移和抑制凋亡等多种作用[2]。VEGF-A可与VEGFR-1及VEGFR-2结合，但主要通过与VEGF-2结合发挥促血管生成作用[3]，缺氧引起细胞缺氧诱导因子1α和2α过表达，继而活化VEGF基因转录。同时突变的K-ras等癌基因、肿瘤抑制基因、一些生长因子及细胞因子等诱导VEGF的表达与分泌。本组研究显示，VEGF在大肠癌中的表达显著高于相应癌旁组织的表达（P<0.01）；VEGF阳性表达在有/无淋巴结转移的大肠癌中有显著差异（P<0.05），提示VEGF在大肠癌的发生、发展、转移过程中起重要作用。在肺癌患者组织和血浆中亦被证明VEGF表达水平显著升高[4-5]，且分期越晚血浆VEGF水平升高越明显。急性白血病患者血液中的VEGF含量明显升高，初始发病者较缓解组升高有统计学意义[6]，证明VEGF含量与病情的临床变化有关，对了解病情、判断预后有帮助。
肿瘤的生长过程有两个显著阶段，即从无血管的血管前期缓慢生长阶段转变为有血管的血管期快速增殖阶段。随着肿瘤性血管的增生肿瘤加速生长，血管为肿瘤生长提供营养。实验证明，肿瘤在无血管时呈线性生长，在血管生长时呈指数生长[7]。目前，MVD检测方法已成为定量分析肿瘤血管生成的金指标。MVD是一个独立而重要的预后因素，高MVD提示肿瘤易发生转移，预后不良[8]。血管亦为肿瘤转移提供重要的途径，有血道远处转移的患者预后往往较差。多数研究表明，VEGF的表达水平与MVD相关[9]，本组研究中VEGF阳性表达组MVD值显著高于VEGF阴性组（P<0.05），提示VEGF在大肠癌中可诱导微血管形成。 增殖能力的活跃程度是恶性肿瘤的重要标志之一，判断肿瘤的增殖能力是鉴别肿瘤的良恶性、提示肿瘤预后的重要指标。相较于高倍镜下进行核分裂计数，稳定的肿瘤增殖标记分子在免疫组化中的应用被认为是判断肿瘤增殖能力的可靠技术。Ki-67为细胞增生指数，是目前公认的稳定的肿瘤增殖标记分子[10-11]。本組研究中，Ki-67在大肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P<0.05），提示Ki-67可用于大肠癌的诊断和肿瘤发生的研究。
综上所述，大肠癌组织中VEGF、Ki-67的表达明显高于癌旁肠组织，且VEGF的表达与有/无淋巴结转移和MVD相关，表明VEGF在肿瘤血管形成、肿瘤发展、转移中扮演重要角色。VEGF及其受体是抗血管生成靶向治疗的主要靶标，VEGF检测对以VEGF为作用靶点的抗血管生成治疗具有明显的指导意义。
参考文献
[1]郭振英，曹伯良.血管内皮生长因子及相关促肿瘤血管生成分子及靶向治疗[J].中华病理学杂志，2010，39（4）：282-285.
[2] Roy H，Bhardwaj S，Yl?-Herttuala S.Biology of vascular endothelial growth factors[J].FEBS Lett，2006，580（12）：2879-2887.
[3] Yamazaki Y，Morita T.Molecular and functional diversity of vascular endothelial growth factors[J].Mol Divers，2006，10（4）：515-527.
[4]甄雪，裴毅.肺癌化疗后血浆VEGF水平与CEA变化的相关性[J].中国医学创新，2013，10（5）：15-16.
[5]吴健波，刁力，阎其涛，等.血管内皮生长因子-C与基质金属蛋白酶-2在肺腺癌中表达的研究[J].中国医学创新，2011，8（12）：13-15.
[6]罗伟，冀林华，李占全，等.急性白血病患者血浆VEGF测定及其临床意义[J].中国医学创新，2013，10（14）：70-71.
[7] Dalal S，Berry A M，Cullinane C J，et al.Vascular endothelial growth factors： a therapeutic target for tumors of the Ewing’s sarcoma family[J].Clin Cancer Res，2005，11（6）：2364-2378.
[8]丁洪基.肿瘤微血管密度检测及其临床病理意义[J].诊断病理学杂志，2008，15（3）：241-243.
[9] Perrone G，Vincenzi B，Santini D，et al.Correlation of p53 and bcl-2 expression with vascular endothelial growth factor（VEGF）， microvessel density（MVD） and clinico-pathological features in colon cancer[J].Cancer Lett，2004，208（2）：227-234.
[10]苏静，郑杰.肿瘤增殖标记分子Ki-67和增殖细胞核抗原及其在病理诊断中的应用[J].中华病理学杂志，2009，38（8）：568-571.
[11] Sandler A，Gray R，Perry M C，et al.Paclitaxel-carboplatin alone or with bevacizumab for non-small-cell lung cancer[J].N Engl J Med，2006，355（24）：2542-2550.
（收稿日期：2013-11-01） （本文编辑：蔡元元）