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关键词：小麦;祖先种;油菜素内酯;BESl/BZRl;序列分析
中图分类号：$512.1 文献标识码：A 文章编号：1000-4440（2019）01-0238-03
高温、冻害、土壤盐渍化等非生物胁迫已经成为小麦稳产高产的重要限制因素。解决这一问题的根本途径在于培育抗逆性强的小麦新品种，并在生产上进行大面积应用，而挖掘和利用与抗逆性密切相关的关键基因能够为培育抗逆性强的小麦品种提供重要的基因资源，因而与抗逆性相关的信号通路及信号通路上的关键基因的功能及序列特征的解析业已成为研究人员关注的热点。油菜素内酯（BR）被称为植物的第六大激素，其类似物在细胞伸长与分裂、维管束分化、叶片形态发生、植物育性、衰老及抗逆性中发挥重要的调节作用。外施油菜素内酯可以提升植物对盐胁迫的抵御能力。拟南芥中的研究结果表明，BESl/BZRl是油菜素内酯（BR）信号通路上的关键转录因子，其活性高低决定着BR信号通路的开放与关闭。在棉花中，BESl/BZRl的表达受到了干旱的诱导：水稻中过表达拟南芥BESl/BZRl基因的转基因株系的耐盐能力明显提升，表明BESl/BZRl与植物抵御非生物胁迫的生物学过程密切相关，并起到了正向调控的作用。在小麦中目前尚未见对该基因的克隆及序列分析等相关研究的报道。
小麦为异源六倍体作物，基因组信息庞大，基因结构复杂，存在着多种基因形态，而基因形态在不同品种中的差异又为基因的标记开发提供了可能。如通过单倍型及关联分析的方式挖掘优异等位基因，为基因在育种中的直接利用奠定了坚实的基础。本研究通过在六倍体小麦、小麦祖先种中分离TaBESl/BZRl基因，并对该基因进行相关的生物信息学分析，研究该基因的序列特征，为以后该基因功能研究及育种利用奠定基础。
1材料与方法
1.1小麦材料
所用小麦材料为沧麦119（六倍体冬小麦）、辽春10号（六倍体春小麦）、3份乌拉尔图小麦（Triticum urartu，AA，2n=2x=14），2份粗山羊草（Aegilops tauschii，DD，2n=2x=14），上述材料由天津市农作物研究所提供。沧麦119和遼春10号亲缘关系较远，冬、春性不同，地理来源不同，耐盐、抗旱、抗冻能力存在较大差异。
生长条件：在生长箱中，采用12 h光照，12 h黑暗，28℃，4 500 k育苗，种子萌发至一叶一心时，部分植株用于DNA提取，另一部分植株4℃处理1 h，迅速取叶片及根系于2.0 m1的离心管中，-80℃贮存，待提取RNA用。
1.2 DNA、RNA提取及cDNA第一链的合成
采用天根生化科技有限公司的植物DNA提取试剂盒（DP321）和多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441）分别进行DNA和RNA提取，采用rI’11errn0的ReveaAid Strand cD-NA Sythesis Kit进行cDNA合成。DNA、RNA及cDNA提取后储存20℃冰箱中，待使用。
1.3聚合酶链式反应
以拟南芥、玉米中公布的BESl/BZRl序列为参照，利用项目组构建的本地序列比对系统中对A、D基因组（A基因组：http：//gigadb.org/dataset/100050;D基因组：http：//gigadb.org/dataset/10～54）进行序列比对，搜寻小麦中BESl/BZRl的序列：通过小麦祖先种的BESl/BZRl序列信息，采用Primer premier 5.0软件设计克隆引物，TaBESl/BZRl一F：5’-AGGAGCAGGGGAGCTAGCATG-3’：TaBESl/BZRl一R：5’一CATTYGTGAGTGCCAGTGCAAT-3’，用于分离基因组序列及编码区序列。
采用15ul体系，L=53℃，以小麦材料的DNA为模板进行基因组扩增，所用高保真酶为TransStart FastPfu DNAPolymerase。
1.4测序
将上述PCR产物，采用1.2%的琼脂糖进行凝胶电泳，并对目的条带进行切胶回收，与Blunt载体连接，通过热击法转入大肠杆菌中，挑取12个单克隆，送至中科希林生物科技有限责任公司测序。
1.5生物信息学分析
使用以下网站及本地软件进行系列生物信息学分析。基因结构预测：http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/：氨基酸序列比对：DNAman;进化分析：MAGE 7.0。
2结果与克隆
2.1 TaBESl/BZRl的克隆
在沧麦119的cDNA中分离得到长为942 bp的编码区序列，在沧麦119及辽春10号的基因组中分离得到长度为1 087 bp的基因组序列。该基因存在2个外显子及1个内含子，内含子占该基因序列的13.34%，位于256-402 bp处。
2.2 TaBESl/BZRl结构特性分析
通过对沧麦1 19中cDNA克隆序列进行手动六框翻译，得到了1条长度为313个氨基酸残基的片段。通过NCBI上公布的部分BESl/BZRl序列信息及潜在的序列信息进行氨基酸序列比对，并通过MEGA 7.0构建N_1进化树。结果表明，小麦的氨基酸序列与大麦、二穗短柄草及水稻的BESl/BZRl的氨基酸序列聚成1类，因此命名此序列为TaBESl/BZRl。氨基酸结构分析结果表明，在该氨基酸的N端具有DUF822结构域，为典型的BESl/BZRl转录因子所具有的保守结构域，与大豆、高梁、谷子中的BESl/BZRl氨基酸序列进行比较发现，DUF822结构域的前端在大豆、高粱、谷子和小麦中高度一致。
2.3祖先种中TaBESl/BZRl序列分析
在小麦祖先种A、D基因组的供体3份乌拉尔图小麦（Triticum urartu，AA），2份粗山羊草（Aegilops tauschii，DD）中进行TaBESl/BZRl的克隆。测序结果表明，在上述5个祖先种中，每种材料仅得到1种序列，其中A基因组的3个供体中每个材料的序列都存在差异，但差异不大，而D基因组的2个供体的序列一致。
2.4 TaBESl/BZRl同源基因查找
通过将氨基酸的保守结构进行提取，并结合Ensemble数据库中的数据信息进行查找发现，具有与DUF822结构域相似性较高的序列一共有22条.其中有4条与TaBESl/BZRl相似度超过90%。表明该基因位于小麦第二同源群的2AS、2BS、2DS上。
2.5 TaBESl/BZRl在沧麦119和辽春10号中的序列分析
经过测序发现，在六倍体冬小麦沧麦119中得到5种序列，而在春小麦辽春10号中得到4种序列。分析结果表明，沧麦119的01序列和辽春10号的01序列一致率为100%，且与祖先种AA供体聚类在一组，说明该序列来源于A基因组。辽春10号03序列和沧麦119的03、05号序列相似度较高，且来源于D基因组。
3讨论
植物通过多种信号通路参与植物对非生物胁迫的响应.外施油菜素内酯能够提高小麦对盐胁迫的抵御能力，说明油菜素内酯信号通路参与了小麦对非生物胁迫的反应，而BESl/BZRl作为油菜素内酯的关键转录因子，控制着油菜素内酯信号通路的开放与关闭，暗示其在小麦抵御盐胁迫中起着重要的作用。
祖先种中的序列分析结果表明，D基因组的2个供体材料中BESl/BZRl序列完全一致，而在3个A基因组的供体材料中序列都不相同，但差异不大。项目组研究发现无论是A基因组还是D基因组中序列信息显示.A基因组供体的BESl/BZRl序列相似度在99.O%以上，而D基因组供体的BESl/BZRl序列相似度为97.2%。说明该基因在A、D基因组上存在一定的差异.为设计基因组特异引物在六倍体中分离单一来源的BESl/BZRl基因组序列提供了可能。
从A、D祖先种的序列进化分析结果可以看出，沧麦119和辽春10号的01序列一致，且来自于A基因组：沧麦119的03、05序列及辽春10号的03序列来源于D基因组.且在六倍体小麦中存在差异，这为该基因在D基因组上开发标记提供了可能。因此小麦BESI/BZRI在育种上的应用具有较大价值，可通过进行多种耐逆性状的关联分析深入研究该基因的功能，并将其开发成可用的分子标记，辅助育种选择，加速育种进程。
中图分类号：$512.1 文献标识码：A 文章编号：1000-4440（2019）01-0238-03
高温、冻害、土壤盐渍化等非生物胁迫已经成为小麦稳产高产的重要限制因素。解决这一问题的根本途径在于培育抗逆性强的小麦新品种，并在生产上进行大面积应用，而挖掘和利用与抗逆性密切相关的关键基因能够为培育抗逆性强的小麦品种提供重要的基因资源，因而与抗逆性相关的信号通路及信号通路上的关键基因的功能及序列特征的解析业已成为研究人员关注的热点。油菜素内酯（BR）被称为植物的第六大激素，其类似物在细胞伸长与分裂、维管束分化、叶片形态发生、植物育性、衰老及抗逆性中发挥重要的调节作用。外施油菜素内酯可以提升植物对盐胁迫的抵御能力。拟南芥中的研究结果表明，BESl/BZRl是油菜素内酯（BR）信号通路上的关键转录因子，其活性高低决定着BR信号通路的开放与关闭。在棉花中，BESl/BZRl的表达受到了干旱的诱导：水稻中过表达拟南芥BESl/BZRl基因的转基因株系的耐盐能力明显提升，表明BESl/BZRl与植物抵御非生物胁迫的生物学过程密切相关，并起到了正向调控的作用。在小麦中目前尚未见对该基因的克隆及序列分析等相关研究的报道。
小麦为异源六倍体作物，基因组信息庞大，基因结构复杂，存在着多种基因形态，而基因形态在不同品种中的差异又为基因的标记开发提供了可能。如通过单倍型及关联分析的方式挖掘优异等位基因，为基因在育种中的直接利用奠定了坚实的基础。本研究通过在六倍体小麦、小麦祖先种中分离TaBESl/BZRl基因，并对该基因进行相关的生物信息学分析，研究该基因的序列特征，为以后该基因功能研究及育种利用奠定基础。
1材料与方法
1.1小麦材料
所用小麦材料为沧麦119（六倍体冬小麦）、辽春10号（六倍体春小麦）、3份乌拉尔图小麦（Triticum urartu，AA，2n=2x=14），2份粗山羊草（Aegilops tauschii，DD，2n=2x=14），上述材料由天津市农作物研究所提供。沧麦119和遼春10号亲缘关系较远，冬、春性不同，地理来源不同，耐盐、抗旱、抗冻能力存在较大差异。
生长条件：在生长箱中，采用12 h光照，12 h黑暗，28℃，4 500 k育苗，种子萌发至一叶一心时，部分植株用于DNA提取，另一部分植株4℃处理1 h，迅速取叶片及根系于2.0 m1的离心管中，-80℃贮存，待提取RNA用。
1.2 DNA、RNA提取及cDNA第一链的合成
采用天根生化科技有限公司的植物DNA提取试剂盒（DP321）和多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441）分别进行DNA和RNA提取，采用rI’11errn0的ReveaAid Strand cD-NA Sythesis Kit进行cDNA合成。DNA、RNA及cDNA提取后储存20℃冰箱中，待使用。
1.3聚合酶链式反应
以拟南芥、玉米中公布的BESl/BZRl序列为参照，利用项目组构建的本地序列比对系统中对A、D基因组（A基因组：http：//gigadb.org/dataset/100050;D基因组：http：//gigadb.org/dataset/10～54）进行序列比对，搜寻小麦中BESl/BZRl的序列：通过小麦祖先种的BESl/BZRl序列信息，采用Primer premier 5.0软件设计克隆引物，TaBESl/BZRl一F：5’-AGGAGCAGGGGAGCTAGCATG-3’：TaBESl/BZRl一R：5’一CATTYGTGAGTGCCAGTGCAAT-3’，用于分离基因组序列及编码区序列。
采用15ul体系，L=53℃，以小麦材料的DNA为模板进行基因组扩增，所用高保真酶为TransStart FastPfu DNAPolymerase。
1.4测序
将上述PCR产物，采用1.2%的琼脂糖进行凝胶电泳，并对目的条带进行切胶回收，与Blunt载体连接，通过热击法转入大肠杆菌中，挑取12个单克隆，送至中科希林生物科技有限责任公司测序。
1.5生物信息学分析
使用以下网站及本地软件进行系列生物信息学分析。基因结构预测：http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/：氨基酸序列比对：DNAman;进化分析：MAGE 7.0。
2结果与克隆
2.1 TaBESl/BZRl的克隆
在沧麦119的cDNA中分离得到长为942 bp的编码区序列，在沧麦119及辽春10号的基因组中分离得到长度为1 087 bp的基因组序列。该基因存在2个外显子及1个内含子，内含子占该基因序列的13.34%，位于256-402 bp处。
2.2 TaBESl/BZRl结构特性分析
通过对沧麦1 19中cDNA克隆序列进行手动六框翻译，得到了1条长度为313个氨基酸残基的片段。通过NCBI上公布的部分BESl/BZRl序列信息及潜在的序列信息进行氨基酸序列比对，并通过MEGA 7.0构建N_1进化树。结果表明，小麦的氨基酸序列与大麦、二穗短柄草及水稻的BESl/BZRl的氨基酸序列聚成1类，因此命名此序列为TaBESl/BZRl。氨基酸结构分析结果表明，在该氨基酸的N端具有DUF822结构域，为典型的BESl/BZRl转录因子所具有的保守结构域，与大豆、高梁、谷子中的BESl/BZRl氨基酸序列进行比较发现，DUF822结构域的前端在大豆、高粱、谷子和小麦中高度一致。
2.3祖先种中TaBESl/BZRl序列分析
在小麦祖先种A、D基因组的供体3份乌拉尔图小麦（Triticum urartu，AA），2份粗山羊草（Aegilops tauschii，DD）中进行TaBESl/BZRl的克隆。测序结果表明，在上述5个祖先种中，每种材料仅得到1种序列，其中A基因组的3个供体中每个材料的序列都存在差异，但差异不大，而D基因组的2个供体的序列一致。
2.4 TaBESl/BZRl同源基因查找
通过将氨基酸的保守结构进行提取，并结合Ensemble数据库中的数据信息进行查找发现，具有与DUF822结构域相似性较高的序列一共有22条.其中有4条与TaBESl/BZRl相似度超过90%。表明该基因位于小麦第二同源群的2AS、2BS、2DS上。
2.5 TaBESl/BZRl在沧麦119和辽春10号中的序列分析
经过测序发现，在六倍体冬小麦沧麦119中得到5种序列，而在春小麦辽春10号中得到4种序列。分析结果表明，沧麦119的01序列和辽春10号的01序列一致率为100%，且与祖先种AA供体聚类在一组，说明该序列来源于A基因组。辽春10号03序列和沧麦119的03、05号序列相似度较高，且来源于D基因组。
3讨论
植物通过多种信号通路参与植物对非生物胁迫的响应.外施油菜素内酯能够提高小麦对盐胁迫的抵御能力，说明油菜素内酯信号通路参与了小麦对非生物胁迫的反应，而BESl/BZRl作为油菜素内酯的关键转录因子，控制着油菜素内酯信号通路的开放与关闭，暗示其在小麦抵御盐胁迫中起着重要的作用。
祖先种中的序列分析结果表明，D基因组的2个供体材料中BESl/BZRl序列完全一致，而在3个A基因组的供体材料中序列都不相同，但差异不大。项目组研究发现无论是A基因组还是D基因组中序列信息显示.A基因组供体的BESl/BZRl序列相似度在99.O%以上，而D基因组供体的BESl/BZRl序列相似度为97.2%。说明该基因在A、D基因组上存在一定的差异.为设计基因组特异引物在六倍体中分离单一来源的BESl/BZRl基因组序列提供了可能。
从A、D祖先种的序列进化分析结果可以看出，沧麦119和辽春10号的01序列一致，且来自于A基因组：沧麦119的03、05序列及辽春10号的03序列来源于D基因组.且在六倍体小麦中存在差异，这为该基因在D基因组上开发标记提供了可能。因此小麦BESI/BZRI在育种上的应用具有较大价值，可通过进行多种耐逆性状的关联分析深入研究该基因的功能，并将其开发成可用的分子标记，辅助育种选择，加速育种进程。