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摘要 目的：挖掘李杰教授中醫药巩固治疗乳腺癌临证经验，探讨李杰教授核心处方作用机制。方法：收集李杰教授门诊病例，筛选出连续服中药时间≥3年的乳腺癌术后患者，运用中医传承辅助平台（V2.5）得到李杰教授临床辨治乳腺癌的高频用药和核心处方，并利用网络药理学方法获取核心处方有效成分、构建网络图和相关作用通路。结果：共有31例患者605首处方纳入研究，得到11味中药组成的核心处方，有效成分与疾病交集靶点166个，富集分析获得相关作用通路43条，构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络、“中药-成分-靶点”和“靶点-通路”网络图。结论：李杰教授以辨病、辨证、辨症与辨体质时空结合的四位一体观为乳腺癌临床思路，治疗上以“固本清源”、疏肝健脾为指导原则，核心处方主要通过肿瘤的细胞增殖、细胞坏死，激素调节，血管生成与肿瘤微环境，炎症与免疫4个可能方面的多靶点调控起效。
关键词 乳腺癌;网络药理学;中医传承辅助平台;数据挖掘;核心处方;中医药巩固治疗;疏肝健脾;固本清源
Professor LI Jie′s Experience on Maintenance Treatment of Breast Cancer with Traditional Chinese
Medicine Based on Data Mining and Network Pharmacology Analysis
WU Jingyuan， XU Bowen， LI Jie
（Department of Oncology， Guang′anmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）
Abstract Objective：To explore Professor LI Jie′s clinical experience in the consolidation treatment of breast cancer with traditional Chinese medicine， and to explore Professor LI Jie′s core prescription mechanism of action. Methods：We collected the outpatient cases of Prof. LI Jie， and then screened out the postoperative breast cancer patients who have taken Chinese medicinal continuously for ≥ 3 years， used the TCM Inheritance Support System to obtain Professor LI Jie′s high-frequency medication and core prescription for clinical treatment of breast cancer， and used the network pharmacology method to obtain the active ingredients of core prescription， constructed the network diagram and related action pathways. Results：A total of 605 prescriptions from 31 patients were included in the study， resulting in a core prescription composed of 11 Chinese medicinal， 166 intersection targets between active ingredients and diseases， 43 related action pathways obtained by enrichment analysis， and PPI， “Chinese medicinal-component-target” and “target-pathway” network maps were constructed. Conclusion：Prof. LI Jie takes the four-in-one combination of disease discrimination， syndrome differentiation， disease discrimination and physical differentiation as the clinical idea of breast cancer. In the treatment，“Guben Qingyuan”and “invigorating the spleen and dispersing the stagnated liver-energy” are taken as the theoretical ideas. The core prescription is mainly through four possible aspects of multi-target regulation：tumor cell proliferation＼ cell necrosis， hormone regulation， angiogenesis and tumor microenvironment， inflammation and immunity.
Keywords Breast cancer; Network pharmacology; Traditional Chinese medicine inheritance support system; Data mining; Core prescription; Maintenance treatment of breast cancer with traditional Chinese medicine; Invigorating the spleen and dispersing the stagnated liver-energy; Guben Qingyuan 中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.023
乳腺癌是我国女性最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率呈逐年上升趋势，发病年龄呈年轻化[1]。手术是乳腺癌的首选治疗手段，但多数患者在术后会出现不同程度的并发症如上肢水肿、皮瓣坏死、皮下积液等，导致生命质量降低、免疫功能下降，并常伴随情绪焦虑抑郁。乳腺癌多归属于中医学乳岩范畴，中医药在逆转乳腺癌多药耐药，抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡，调节代谢和免疫等方面有着一定优势[2-3]，有助于延长患者生存期及提高生命质量。
传统中药及复方治疗疾病具有多靶点、多途径、疗效显著、不良反应低等优点，其所含有效成分复杂、生物效价高，但具体起效机制一直是研究热点和难点。李杰是医学博士，留美博士后，博士研究生导师，中国中医科学院广安门医院肿瘤科主任医师，北京中医药大学教授，2019年9月入选国家百千万人才工程，荣获国家有突出贡献中青年专家。近五年荣获首届北京中医行业榜样、首都中青年名中医等。李杰教授长期从事临床，积累了丰富的实践经验，在乳腺癌的术后并发症及防止复发转移方面有独到体会并取得一定成效。本研究采用中医传承辅助平台，在挖掘李杰教授治疗乳腺癌的高频用药、核心处方基础上同时引入网络药理学的方法学思路，强调多靶点、网络性调节，通过研究中药复方的通路和生物学机制，从整体的高度全方位、多角度分析李杰教授经验及其复方作用机制，总结其临床用药规律，以期为患者治疗带来获益，为中西医诊疗乳腺癌提供方法。
1 资料与方法
1.1 数据来源 选取2009年1月至2019年12月李杰教授在中国中医科学院广安门医院肿瘤科门诊的乳腺癌患者处方数据。
1.2 纳入标准 1）纳入患者符合临床乳腺癌诊断标准，有病理学检查者;2）纳入患者为乳腺癌术后，放疗及（或）化疗疗程结束后连续服中药时间≥3年;3）所纳入的中药处方完整如中药名称及用量均记录清楚，患者信息完整如姓名、性别、年龄等。
1.3 排除标准 1）排除乳腺癌合并其他恶性肿瘤患者;2）排除出现复发转移的乳腺癌患者;3）排除同步进行放、化疗的患者;4）排除数据不准确、不完整的处方。
1.4 基于中医传承辅助平台的数据挖掘 中药名称录入参考2015年版《中华人民共和国药典》[4]进行规范，如淫羊藿录为淫羊藿，淮山录为山药。登陆中医传承辅助平台（V2.5）的“临床采集”板块，将依据纳入、排除标准筛选出的31例患者的605首处方信息录入，建立方剂和医案数据库，并在“平台管理”板块进行数据核对，确保数据准确。利用中医传承辅助平台“统计报表”板块中的“药物频次统计”“性味归经统计”和“组方规律”功能，采取频次统计、聚类分析等方法对605首处方进行深入挖掘获取高频用药和核心处方。
组方规律：登陆中医传承辅助平台的“数据分析”板块，选择“方剂统计”，点击“组方规律”，根据结果预览及临床实际逐步调整至支持度个数（表示在整体数据样本中同时出现的次数）为242，置信度（表示左边药物A出现同时右边药物B出现的概率）为0.99，分别点击“规则分析”“网络展示”模块，得出相应结果。设置支持度个数242（相当于整体数据的40%）置信度0.99，得到多味药之间的不同组合，进行规则分析。
1.5 基于网络药理学的数据分析 由中医传承辅助平台获取李杰教授治疗乳腺癌术后核心处方，并利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）得到药物相关有效成分及作用靶点。在Genecards疾病靶点数据库以“乳腺癌术后（Postoperative Breast Cancer）”为关键词筛选疾病靶點，并取得药物相关靶点和疾病相关靶点的交集，运用Cytoscape 3.7.2软件绘制核心处方的“中药-成分-靶点”网络图。在String数据库中对核心处方治疗乳腺癌术后的相关靶点构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。基于核心作用靶点在Metascape数据库获取靶点的京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析结果，构建“靶点-通路”网络图，对核心处方的作用机制进行分析。作用靶点的PPI网络：将疾病-药物交集靶点导入String数据库，根据靶点蛋白间interaction score≥0.99获得蛋白间相互关系数据并导入Cytoscape软件绘制PPI网络图。靶点-通路网络：为直观展示核心处方作用靶点和对应通路之间关系，利用Cytoscape软件构建“作用靶点-作用通路”网络模型图。
2 结果
2.1 药物频次 605首中药处方中，共涉及中药228味，使用≥100频次的中药有32味。见表1。主要可分为：1）清热药：包括清热解毒药如白花蛇舌草、蒲公英、半枝莲，清热燥湿药如黄芩，清热凉血药如赤芍，清热泻火药如知母、芦根等;2）补虚药：包括补气药如黄芪、甘草、山药，活血药如白芍、莪术，补阴药如女贞子、墨旱莲等;3）消食药：生麦芽、鸡内金等;4）理气活血药：枳壳、预知子、牛膝、郁金、莪术等;5）祛湿化痰药：浙贝母、瓦楞子、清半夏、薏苡仁等。
2.2 性味归经 四气归类以寒性药物为主，其次为平性和温性;五味以甘、苦、辛为主。见表2。归经以肝经频次最高，其次是胃经。见表3。
2.3 组方规律
设置支持度个数242（相当于整体数据的40%）置信度0.99，得到多味药之间的不同组合，进行规则分析，其不同的组合方式体现李杰教授临证辨治中不同的组方思路。见表4。
将这11味中药枳壳、蛇舌草、甘草、生麦芽、鸡内金、黄芪、预知子、牛膝、郁金、蒲公英、浙贝母之间的关联性进行直观网络化展示。这11味药可视为李杰教授处方用药核心，进行处方规律分析和作用机制探讨。见图1。 2.4 核心处方的中药-成分-靶点网络图 通过中医传承辅助平台获得11味中药构成的李杰教授巩固治疗乳腺癌的核心处方，在TCMSP上根据生物口服利用度≥30%、类药性≥0.18筛选出各药物有效成分，合计238个。通过Genecards检索获取乳腺癌术后的疾病靶点1 937个，将二者取交集获得核心处方治疗乳腺癌术后的相关靶点166个。见图2。其中浙贝母5个、蒲公英0个、郁金3个、鸡内金0个、甘草86个、预知子3个、枳壳5个、麦芽13个、牛膝16个、黄芪15个、白花蛇舌草5个。运用Cytoscape 3.7.2构建“中药-有效成分-疾病靶点”网络图。
见图3。该网络包含303个节点（Nodes）和2 214条边（Edges），居于正中处的正方形节点代表靶点蛋白，各六边形节点有效成分绕三角形节点中药呈圆环状分布，边代表相互关系，通过此网络验证了李杰教授巩固治疗乳腺癌核心处方是通过多成分、多靶点、整体调节的方式发挥作用。
2.5 作用靶点的PPI网络 PPI网络中共有70个节点（靶点蛋白）、82条边（PPI）。节点大小和颜色表示该节点度值的大小，节点越大，由蓝色变橙色对应的度值越大。边的粗细表示结合分数，边越粗结合分数值越大。结果表明，丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKTI，11）、原癌基因JUN（JUN，8）和信号转导与转录激活因子3（STAT3，8）度值排名靠前，为3个关键靶点。见图4。
2.6 通路富集分析和靶点-通路网络 利用Metascpae网站对166个靶点进行KEGG通路富集分析（P<0.01）筛选出与乳腺癌相关通路43条，主要涉及乳腺癌的细胞增殖、细胞死亡、血管生成、激素水平、肿瘤微环境、炎症反应和免疫反应等。将获得的KEGG通路按校正P值进行排序。见图5。气泡越大，富集基因数目越多，富集越相关，气泡颜色越红。
2.7 靶点-通路网络 网络中共有105个节点、333条边，正方形节点为靶点，六边形节点为通路，节点大小表示该节点度值的大小。见图6。
3 讨论
李杰教授以辨病、辨证、辨症与辨体质时空结合的四位一体观[5]为乳腺癌诊疗思路，主张从肝、脾、胃论治，痰、瘀、火、毒是主要病因，肝郁脾虚是乳腺癌发生、发展和转移的核心病机[6]，治疗上贯彻“固本清源”思想[7]，以疏肝健脾为治疗原则，我们从病因病机、处方规律、机制探讨3方面具体分析。
3.1 病因病机 李杰教授用药以肝经为主其次为胃经，体现的是疏肝健脾、顾护脾胃思想。情志不遂、郁怒伤肝，而乳头属肝，肝失疏泄、经气郁滞则胸胁胀满窜通、乳头疼痛。肝失条达横乘脾土，脾失健运则胃脏虚弱，乳房属胃，脾胃互为表里也是气机升降的枢纽，脾胃运化失调则痰浊内生，痰凝气聚循经入乳，发为乳岩。故李杰教授治疗乳腺癌主张从肝、脾、胃论治，常用黄芪、郁金、预知子、合欢皮、生麦芽、鸡内金等疏肝理气、健脾调胃之品。
李杰教授认为素体禀赋不足之人，气郁痰凝、瘀血互结，日久化火成毒，发为乳岩。因此对引起乳腺癌的病因痰、瘀、火、毒等因素加以预防或阻断，有利于巩固乳腺癌术后治疗防止其复发转移。本研究纳入的31例服用中药期间未出现复发转移的患者处方中，高频药物为清热解毒、理气活血、祛湿化痰、健脾消食药，针对病因从根本上驱邪抗癌以扶正培本，有利于延长患者生存期，防止乳腺癌复发转移。药性以寒、平、温为主，药味以甘、苦、辛居多。如寒苦之品有清热泻火、凉血解毒、软坚散结的功效，能驱邪抗癌、解毒清源以降低肿瘤复发转移概率[8]。但苦寒之品易损伤胃气，所以应同时配以性平温、辛温之品。一方面防止苦寒败胃，“有胃气则生，无胃气则死”;另一方面“病痰饮者当以温药和之”，温性药可发挥振奋阳气、化痰散结之效。甘味药补益和中、调胃健脾，甘平之品可发挥益气固本之功，扶正培本、充盛正气以改善机体内环境起到抑制肿瘤细胞的作用。其中的肝脾同调思想也符合“肝苦急，急食甘以缓之”“肝欲散，急食辛以散之”“脾欲缓，急食甘以缓之，用苦泻之”的《黄帝内经》条文。
3.2 处方规律 通过对组方规律中的11味中药进行规则分析，发现总不离枳壳、甘草、鸡内金、生麦芽，证明这四味药为李杰教授处方基础。鸡内金、生麦芽为健脾开胃对药，脾胃为后天之本、气血生化之源，乳腺癌术后、化疗后的患者都易损伤脾胃，“正虚则成岩”，两药运脾开胃、匡扶正气以“固本”;枳壳、生麦芽相配尚能疏肝理气、畅达情志以“清源”;辅以甘草调和益气，体现李杰教授“固本清源”的组方思想。同时“固本清源”理论在乳腺癌的不同阶段，也应有其不同侧重点。在乳腺癌术后早期正气尚盛，邪毒初起，应以驱邪为主，兼以扶正，此时可“清源”抗癌，采用清热解毒、软坚散结法治疗乳腺癌，李杰教授常加入黄芩、仙鹤草、青皮、陈皮、牡蛎、清半夏等药。若病情发展至晚期，此时正气已虚，应培补脾胃、益气养血以“固本”，李杰教授常加入黄芪、党参、山药、当归、川芎等，着重减轻患者症状，提高生命质量。
在四位一体观理念下，李杰教授以疏肝健脾为基本原则，辨病为纲，辨证为目;以癥为经，以体为纬。辨病为先，整体审查分析乳腺癌治疗的基本矛盾;辨证为主，四诊合参判断其证型的主要矛盾。在综合考虑病证的基础上随症加味，同时辨体质溯病源，将乳腺癌分为肝郁型脾虚、瘀毒内阻、热毒壅盛、气血亏虚、肝肾亏虚5种证型[9]。以枳壳、甘草、鸡内金、生麦芽为基础方，我们进一步挖掘相关组合。以郁金、预知子配合枳壳、甘草、鸡内金、生麦芽，发挥理气疏肝功效，郁金行气疏肝，预知子理气散结，“气病则乳病”，两药疏肝解郁、调畅气机顺应肝生长升发、条达舒畅的特性以清其源流，可治疗乳腺癌肝郁型脾虚证。以白花蛇舌草或蒲公英相配，发挥清热疏肝功效，治疗乳腺癌热毒壅盛证。蒲公英苦寒，善于消肿散结;白花蛇舌草解毒消肿，两药清热解毒，可清肝经之火，“邪去正方安”体现“清源”思想，驱邪以抗癌，阻断疾病进程。配合浙贝母，发挥化痰健脾功效，乳腺癌的发生与痰凝气阻有关，浙贝母能清热化痰，使痰生化无源，以四味基础中药为底方，李杰教授还常加入山慈菇、清半夏、莪术等化痰散结、活血行气，用于治疗乳腺癌瘀毒内阻证。配合黄芪，发挥益气健脾之效，再加入川芎、鸡血藤等治疗乳腺癌气血亏虚证。以牛膝为代表，加入骨碎补、桑寄生、补骨脂发挥培补肝肾之功，治疗乳腺癌肝肾亏虚证。因乳腺癌易发生骨转移，也可提前加入以护骨补肾，“先安未受邪之地”。 3.3 机制探讨 中药具有多成分，多靶点，多种调节方式的特点[10]，中药复方的起效机制也是一个复杂多系统、多靶点的综合调控网络，以西方单一靶标和单一成分的研究方法难以反映中药的系统性，不能科学地解释中草药复方的物质基础和处方规律[11]。肿瘤作为一种系统性复杂疾病，我们认为中药复方在防止肿瘤复发转移的过程中必然通过多途径、多靶点协同干预起效。李杰教授巩固治疗乳腺癌的核心处方基于算法分析组合而成，遣方用药具有一定代表性，我们进一步通过网络药理学的方法对核心处方治疗乳腺癌术后的起效机制进行探讨与分析，得到的富集通路大致可分为以下4类。1）激素水平调节：乳腺癌为典型的激素依赖性肿瘤，雌激素和雌激素受体（ER）是其发展转移的重要途径，雌激素不平衡会导致雌激素代谢形成不稳定DNA加合物，从而导致乳腺癌的发生[12]。而雌激素受体被激活时负责许多下游信号通路的介导如PI3K/AKT/mTOR、Ras/Raf/MAPK，这些通路起着促进癌症发展的转录因子的作用[13-14]。催乳素可参与应激反应，促进细胞的增殖和分裂[15]，血清催乳素水平高的患者相对具有较差的预后因子[16]，催乳素主要通过PRLR-JAK/STAT5信号通路介导，并与受体结合诱导受体二聚化和JAK2激活，调控基因的转录，促进肿瘤分化和降低内分泌治疗敏感性[17]。核心处方通过作用于雌激素和催乳素信号通路，可能通过竞争性抑制雌激素，减少雌激素的代谢而降低乳腺癌的复发，通过抑制催乳素增强乳腺癌细胞对内分泌药物的敏感性，减少耐药的发生。2）血管生成和肿瘤微环境：血管内皮生长因子（VEGF）具有刺激血管生成、增加血管通透性，产生白细胞黏附作用。相关医学研究证实，VEGF的产生在极大程度上改变周围血管及胞外基质，为乳腺原位癌演变成浸润癌、乳腺癌向淋巴结转移提供良好的生长条件。低氧是驱动肿瘤转移性进展的一个重要微环境因素，可直接上调葡萄糖转运、血管生成、厌氧代谢、细胞成活、侵袭、转移相关基因的表达使细胞适应缺氧环境[18-19]，HIF-1是低氧诱导转录因子，可影响转移信号通路的多个步骤，促进肿瘤细胞的上皮细胞-间充质转化（EMT），上调血管生成素样蛋白，诱导VEGF、血管生成素2等支持肿瘤细胞转移[20]。核心处方的作用机制可能为干扰VEGF信号通路，降低或阻断肿瘤血管血流，使异常的肿瘤血管趋于正常，调整低氧的肿瘤微循环使之趋于“正常化”，消除潜在的癌变细胞，发挥重要的抑制乳腺癌细胞作用。3）细胞增殖、坏死、凋亡：前20位通路富集结果中有7条通路涉及乳腺癌细胞的增殖和凋亡。ErbB信号通路与生长因子受体家族息息相关，其通路的持续性激活导致了癌基因或通路偏好性肿瘤的发生。核因子κB是參与细胞应答外源刺激的转录调控的转录因子，在肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或白细胞介素（ILs）等细胞信号激活后，IκB激酶复合体发生活化，引起IκB蛋白磷酸化和进一步泛素化降解，降解暴露核因子κB核定位信号，核因子κB形成同源二聚体或异源二聚体参与多种病理生理过程的基因表达，影响细胞增殖和凋亡[21]。在PI3K-AKT信号通路中，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）激活后可催化3，4-二磷酸磷脂酰（肌醇CPIP2）转化为3，4，5三磷酸磷脂酰（肌醇CPIP3），后者作为第二信使参与AKT激活[22]。AKT通过磷酸化抑制BAD、Caspase 9和FOXO1转录因子发挥调控抗凋亡作用，其中BAD可以负调控抗凋亡蛋白BCL-X，Caspase 9属于促凋亡蛋白酶，FOXO1转录因子可调控多种促凋亡基因的表达。此外乳腺癌中ERBB2扩增也会导致AKT活化。AKT通过激活Ikb激酶，上调核因子κB活性，增强细胞增殖并抑制凋亡。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者有4个亚族，p38和JNK通路的激活和细胞凋亡有关，ERK通路在生长因子介导的细胞增殖过程中起重要作用，ERK5在个体生长及肿瘤的发生发展中起桥梁作用[23]。JAK-STAT通路为Janus激酶信号转录激活子信号通路，当STATs被JAKs磷酸化后可引起STAT二聚化、核转位及基因转录的改变[24]。STAT家族中STAT1所调控的相关信号通路更倾向于促进细胞的凋亡并且起到抑制细胞增殖的能力，而STAT3信号通路则与乳腺癌细胞的生长增殖有着密切的联系[25]。肿瘤坏死因子信号通路中，TNF可以调控核因子κB和JNK通路，二者的平衡调控细胞增殖和成活。由此可见，核心处方可通过ERBB、FOXO、核因子κB、PI3K-AKT、MAPK、Jak-STAT、肿瘤坏死因子等以上多种通路影响肿瘤细胞的增殖，导致肿瘤细胞坏死、凋亡，一定程度降低乳腺癌复发转移率。4）炎症反应和免疫应答：微环境中慢性炎症的持续存在对启动、维持和促进肿瘤生长具有重要意义，Th17细胞是最早参与抗感染免疫的效应性T细胞，IL-17是其产生的炎症介质，与炎症反应、免疫应答、免疫排斥相关[26]。慢性炎症可直接影响与Th17分化和IL-17的产生都有关的STAT信号通路，从而促进肿瘤形成。T细胞具有强大的杀伤肿瘤作用，通过细胞毒性T淋巴细胞（CTL）直接发挥作用或通过多种CD4+T细胞依赖的效应机制间接发挥作用。Toll样受体（TLRs）参与识别病原体相关分子模式，介导免疫细胞的激活，在机体固有免疫中起重要作用，TLR2和TLR4能够诱导炎症反应的发生，通过炎症反应微环境的产生进而促进肿瘤的形成[27]。核心处方通过T细胞、Th17、IL-17、Toll样受体等信号通路提高免疫应答活化的可能，激活机体的免疫系统从而杀伤肿瘤细胞。
本研究基于中医传承辅助平台（V2.5），深入挖掘李杰教授临证高频药物和处方规律，对乳腺癌病-方-药之间的内在联系进行了有益探索，以核心处方为落脚点，基于网络药理学分析处方可能的作用机制。李杰教授在辨病、辨证、辨症与辨体质时空结合的四位一体观和“固本清源”、疏肝健脾的治疗指导下的核心处方针对乳腺癌的细胞增殖、坏死，激素调节，血管生成与肿瘤微环境，炎症与免疫等多靶点、多成分、多通路起效，但仍需配合进一步的相关实验验证和阐述。本研究结果为我们进一步挖掘乳腺癌的新方新药提供一定思路和方法，也为基础和临床研究提供了线索和依据。 参考文献
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（2020-04-06收稿 责任编辑：杨觉雄）
基金项目：国家自然科学基金项目（81774289）——基于细胞焦亡通路探讨疏肝健脾方调控乳腺癌MDSC-NKT细胞免疫编辑机制研究
作者简介：吴静远（1996.04—），女，硕士研究生在读，研究方向：中医药干预肿瘤复发转移的研究，E-mail：[email protected]
通信作者：李杰（1971.06—），男，博士，主任医师，博士研究生导师，研究方向：中医药干预肿瘤复发转移的研究，E-mail：[email protected]
关键词 乳腺癌;网络药理学;中医传承辅助平台;数据挖掘;核心处方;中医药巩固治疗;疏肝健脾;固本清源
Professor LI Jie′s Experience on Maintenance Treatment of Breast Cancer with Traditional Chinese
Medicine Based on Data Mining and Network Pharmacology Analysis
WU Jingyuan， XU Bowen， LI Jie
（Department of Oncology， Guang′anmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）
Abstract Objective：To explore Professor LI Jie′s clinical experience in the consolidation treatment of breast cancer with traditional Chinese medicine， and to explore Professor LI Jie′s core prescription mechanism of action. Methods：We collected the outpatient cases of Prof. LI Jie， and then screened out the postoperative breast cancer patients who have taken Chinese medicinal continuously for ≥ 3 years， used the TCM Inheritance Support System to obtain Professor LI Jie′s high-frequency medication and core prescription for clinical treatment of breast cancer， and used the network pharmacology method to obtain the active ingredients of core prescription， constructed the network diagram and related action pathways. Results：A total of 605 prescriptions from 31 patients were included in the study， resulting in a core prescription composed of 11 Chinese medicinal， 166 intersection targets between active ingredients and diseases， 43 related action pathways obtained by enrichment analysis， and PPI， “Chinese medicinal-component-target” and “target-pathway” network maps were constructed. Conclusion：Prof. LI Jie takes the four-in-one combination of disease discrimination， syndrome differentiation， disease discrimination and physical differentiation as the clinical idea of breast cancer. In the treatment，“Guben Qingyuan”and “invigorating the spleen and dispersing the stagnated liver-energy” are taken as the theoretical ideas. The core prescription is mainly through four possible aspects of multi-target regulation：tumor cell proliferation＼ cell necrosis， hormone regulation， angiogenesis and tumor microenvironment， inflammation and immunity.
Keywords Breast cancer; Network pharmacology; Traditional Chinese medicine inheritance support system; Data mining; Core prescription; Maintenance treatment of breast cancer with traditional Chinese medicine; Invigorating the spleen and dispersing the stagnated liver-energy; Guben Qingyuan 中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.023
乳腺癌是我国女性最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率呈逐年上升趋势，发病年龄呈年轻化[1]。手术是乳腺癌的首选治疗手段，但多数患者在术后会出现不同程度的并发症如上肢水肿、皮瓣坏死、皮下积液等，导致生命质量降低、免疫功能下降，并常伴随情绪焦虑抑郁。乳腺癌多归属于中医学乳岩范畴，中医药在逆转乳腺癌多药耐药，抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡，调节代谢和免疫等方面有着一定优势[2-3]，有助于延长患者生存期及提高生命质量。
传统中药及复方治疗疾病具有多靶点、多途径、疗效显著、不良反应低等优点，其所含有效成分复杂、生物效价高，但具体起效机制一直是研究热点和难点。李杰是医学博士，留美博士后，博士研究生导师，中国中医科学院广安门医院肿瘤科主任医师，北京中医药大学教授，2019年9月入选国家百千万人才工程，荣获国家有突出贡献中青年专家。近五年荣获首届北京中医行业榜样、首都中青年名中医等。李杰教授长期从事临床，积累了丰富的实践经验，在乳腺癌的术后并发症及防止复发转移方面有独到体会并取得一定成效。本研究采用中医传承辅助平台，在挖掘李杰教授治疗乳腺癌的高频用药、核心处方基础上同时引入网络药理学的方法学思路，强调多靶点、网络性调节，通过研究中药复方的通路和生物学机制，从整体的高度全方位、多角度分析李杰教授经验及其复方作用机制，总结其临床用药规律，以期为患者治疗带来获益，为中西医诊疗乳腺癌提供方法。
1 资料与方法
1.1 数据来源 选取2009年1月至2019年12月李杰教授在中国中医科学院广安门医院肿瘤科门诊的乳腺癌患者处方数据。
1.2 纳入标准 1）纳入患者符合临床乳腺癌诊断标准，有病理学检查者;2）纳入患者为乳腺癌术后，放疗及（或）化疗疗程结束后连续服中药时间≥3年;3）所纳入的中药处方完整如中药名称及用量均记录清楚，患者信息完整如姓名、性别、年龄等。
1.3 排除标准 1）排除乳腺癌合并其他恶性肿瘤患者;2）排除出现复发转移的乳腺癌患者;3）排除同步进行放、化疗的患者;4）排除数据不准确、不完整的处方。
1.4 基于中医传承辅助平台的数据挖掘 中药名称录入参考2015年版《中华人民共和国药典》[4]进行规范，如淫羊藿录为淫羊藿，淮山录为山药。登陆中医传承辅助平台（V2.5）的“临床采集”板块，将依据纳入、排除标准筛选出的31例患者的605首处方信息录入，建立方剂和医案数据库，并在“平台管理”板块进行数据核对，确保数据准确。利用中医传承辅助平台“统计报表”板块中的“药物频次统计”“性味归经统计”和“组方规律”功能，采取频次统计、聚类分析等方法对605首处方进行深入挖掘获取高频用药和核心处方。
组方规律：登陆中医传承辅助平台的“数据分析”板块，选择“方剂统计”，点击“组方规律”，根据结果预览及临床实际逐步调整至支持度个数（表示在整体数据样本中同时出现的次数）为242，置信度（表示左边药物A出现同时右边药物B出现的概率）为0.99，分别点击“规则分析”“网络展示”模块，得出相应结果。设置支持度个数242（相当于整体数据的40%）置信度0.99，得到多味药之间的不同组合，进行规则分析。
1.5 基于网络药理学的数据分析 由中医传承辅助平台获取李杰教授治疗乳腺癌术后核心处方，并利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）得到药物相关有效成分及作用靶点。在Genecards疾病靶点数据库以“乳腺癌术后（Postoperative Breast Cancer）”为关键词筛选疾病靶點，并取得药物相关靶点和疾病相关靶点的交集，运用Cytoscape 3.7.2软件绘制核心处方的“中药-成分-靶点”网络图。在String数据库中对核心处方治疗乳腺癌术后的相关靶点构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。基于核心作用靶点在Metascape数据库获取靶点的京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析结果，构建“靶点-通路”网络图，对核心处方的作用机制进行分析。作用靶点的PPI网络：将疾病-药物交集靶点导入String数据库，根据靶点蛋白间interaction score≥0.99获得蛋白间相互关系数据并导入Cytoscape软件绘制PPI网络图。靶点-通路网络：为直观展示核心处方作用靶点和对应通路之间关系，利用Cytoscape软件构建“作用靶点-作用通路”网络模型图。
2 结果
2.1 药物频次 605首中药处方中，共涉及中药228味，使用≥100频次的中药有32味。见表1。主要可分为：1）清热药：包括清热解毒药如白花蛇舌草、蒲公英、半枝莲，清热燥湿药如黄芩，清热凉血药如赤芍，清热泻火药如知母、芦根等;2）补虚药：包括补气药如黄芪、甘草、山药，活血药如白芍、莪术，补阴药如女贞子、墨旱莲等;3）消食药：生麦芽、鸡内金等;4）理气活血药：枳壳、预知子、牛膝、郁金、莪术等;5）祛湿化痰药：浙贝母、瓦楞子、清半夏、薏苡仁等。
2.2 性味归经 四气归类以寒性药物为主，其次为平性和温性;五味以甘、苦、辛为主。见表2。归经以肝经频次最高，其次是胃经。见表3。
2.3 组方规律
设置支持度个数242（相当于整体数据的40%）置信度0.99，得到多味药之间的不同组合，进行规则分析，其不同的组合方式体现李杰教授临证辨治中不同的组方思路。见表4。
将这11味中药枳壳、蛇舌草、甘草、生麦芽、鸡内金、黄芪、预知子、牛膝、郁金、蒲公英、浙贝母之间的关联性进行直观网络化展示。这11味药可视为李杰教授处方用药核心，进行处方规律分析和作用机制探讨。见图1。 2.4 核心处方的中药-成分-靶点网络图 通过中医传承辅助平台获得11味中药构成的李杰教授巩固治疗乳腺癌的核心处方，在TCMSP上根据生物口服利用度≥30%、类药性≥0.18筛选出各药物有效成分，合计238个。通过Genecards检索获取乳腺癌术后的疾病靶点1 937个，将二者取交集获得核心处方治疗乳腺癌术后的相关靶点166个。见图2。其中浙贝母5个、蒲公英0个、郁金3个、鸡内金0个、甘草86个、预知子3个、枳壳5个、麦芽13个、牛膝16个、黄芪15个、白花蛇舌草5个。运用Cytoscape 3.7.2构建“中药-有效成分-疾病靶点”网络图。
见图3。该网络包含303个节点（Nodes）和2 214条边（Edges），居于正中处的正方形节点代表靶点蛋白，各六边形节点有效成分绕三角形节点中药呈圆环状分布，边代表相互关系，通过此网络验证了李杰教授巩固治疗乳腺癌核心处方是通过多成分、多靶点、整体调节的方式发挥作用。
2.5 作用靶点的PPI网络 PPI网络中共有70个节点（靶点蛋白）、82条边（PPI）。节点大小和颜色表示该节点度值的大小，节点越大，由蓝色变橙色对应的度值越大。边的粗细表示结合分数，边越粗结合分数值越大。结果表明，丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKTI，11）、原癌基因JUN（JUN，8）和信号转导与转录激活因子3（STAT3，8）度值排名靠前，为3个关键靶点。见图4。
2.6 通路富集分析和靶点-通路网络 利用Metascpae网站对166个靶点进行KEGG通路富集分析（P<0.01）筛选出与乳腺癌相关通路43条，主要涉及乳腺癌的细胞增殖、细胞死亡、血管生成、激素水平、肿瘤微环境、炎症反应和免疫反应等。将获得的KEGG通路按校正P值进行排序。见图5。气泡越大，富集基因数目越多，富集越相关，气泡颜色越红。
2.7 靶点-通路网络 网络中共有105个节点、333条边，正方形节点为靶点，六边形节点为通路，节点大小表示该节点度值的大小。见图6。
3 讨论
李杰教授以辨病、辨证、辨症与辨体质时空结合的四位一体观[5]为乳腺癌诊疗思路，主张从肝、脾、胃论治，痰、瘀、火、毒是主要病因，肝郁脾虚是乳腺癌发生、发展和转移的核心病机[6]，治疗上贯彻“固本清源”思想[7]，以疏肝健脾为治疗原则，我们从病因病机、处方规律、机制探讨3方面具体分析。
3.1 病因病机 李杰教授用药以肝经为主其次为胃经，体现的是疏肝健脾、顾护脾胃思想。情志不遂、郁怒伤肝，而乳头属肝，肝失疏泄、经气郁滞则胸胁胀满窜通、乳头疼痛。肝失条达横乘脾土，脾失健运则胃脏虚弱，乳房属胃，脾胃互为表里也是气机升降的枢纽，脾胃运化失调则痰浊内生，痰凝气聚循经入乳，发为乳岩。故李杰教授治疗乳腺癌主张从肝、脾、胃论治，常用黄芪、郁金、预知子、合欢皮、生麦芽、鸡内金等疏肝理气、健脾调胃之品。
李杰教授认为素体禀赋不足之人，气郁痰凝、瘀血互结，日久化火成毒，发为乳岩。因此对引起乳腺癌的病因痰、瘀、火、毒等因素加以预防或阻断，有利于巩固乳腺癌术后治疗防止其复发转移。本研究纳入的31例服用中药期间未出现复发转移的患者处方中，高频药物为清热解毒、理气活血、祛湿化痰、健脾消食药，针对病因从根本上驱邪抗癌以扶正培本，有利于延长患者生存期，防止乳腺癌复发转移。药性以寒、平、温为主，药味以甘、苦、辛居多。如寒苦之品有清热泻火、凉血解毒、软坚散结的功效，能驱邪抗癌、解毒清源以降低肿瘤复发转移概率[8]。但苦寒之品易损伤胃气，所以应同时配以性平温、辛温之品。一方面防止苦寒败胃，“有胃气则生，无胃气则死”;另一方面“病痰饮者当以温药和之”，温性药可发挥振奋阳气、化痰散结之效。甘味药补益和中、调胃健脾，甘平之品可发挥益气固本之功，扶正培本、充盛正气以改善机体内环境起到抑制肿瘤细胞的作用。其中的肝脾同调思想也符合“肝苦急，急食甘以缓之”“肝欲散，急食辛以散之”“脾欲缓，急食甘以缓之，用苦泻之”的《黄帝内经》条文。
3.2 处方规律 通过对组方规律中的11味中药进行规则分析，发现总不离枳壳、甘草、鸡内金、生麦芽，证明这四味药为李杰教授处方基础。鸡内金、生麦芽为健脾开胃对药，脾胃为后天之本、气血生化之源，乳腺癌术后、化疗后的患者都易损伤脾胃，“正虚则成岩”，两药运脾开胃、匡扶正气以“固本”;枳壳、生麦芽相配尚能疏肝理气、畅达情志以“清源”;辅以甘草调和益气，体现李杰教授“固本清源”的组方思想。同时“固本清源”理论在乳腺癌的不同阶段，也应有其不同侧重点。在乳腺癌术后早期正气尚盛，邪毒初起，应以驱邪为主，兼以扶正，此时可“清源”抗癌，采用清热解毒、软坚散结法治疗乳腺癌，李杰教授常加入黄芩、仙鹤草、青皮、陈皮、牡蛎、清半夏等药。若病情发展至晚期，此时正气已虚，应培补脾胃、益气养血以“固本”，李杰教授常加入黄芪、党参、山药、当归、川芎等，着重减轻患者症状，提高生命质量。
在四位一体观理念下，李杰教授以疏肝健脾为基本原则，辨病为纲，辨证为目;以癥为经，以体为纬。辨病为先，整体审查分析乳腺癌治疗的基本矛盾;辨证为主，四诊合参判断其证型的主要矛盾。在综合考虑病证的基础上随症加味，同时辨体质溯病源，将乳腺癌分为肝郁型脾虚、瘀毒内阻、热毒壅盛、气血亏虚、肝肾亏虚5种证型[9]。以枳壳、甘草、鸡内金、生麦芽为基础方，我们进一步挖掘相关组合。以郁金、预知子配合枳壳、甘草、鸡内金、生麦芽，发挥理气疏肝功效，郁金行气疏肝，预知子理气散结，“气病则乳病”，两药疏肝解郁、调畅气机顺应肝生长升发、条达舒畅的特性以清其源流，可治疗乳腺癌肝郁型脾虚证。以白花蛇舌草或蒲公英相配，发挥清热疏肝功效，治疗乳腺癌热毒壅盛证。蒲公英苦寒，善于消肿散结;白花蛇舌草解毒消肿，两药清热解毒，可清肝经之火，“邪去正方安”体现“清源”思想，驱邪以抗癌，阻断疾病进程。配合浙贝母，发挥化痰健脾功效，乳腺癌的发生与痰凝气阻有关，浙贝母能清热化痰，使痰生化无源，以四味基础中药为底方，李杰教授还常加入山慈菇、清半夏、莪术等化痰散结、活血行气，用于治疗乳腺癌瘀毒内阻证。配合黄芪，发挥益气健脾之效，再加入川芎、鸡血藤等治疗乳腺癌气血亏虚证。以牛膝为代表，加入骨碎补、桑寄生、补骨脂发挥培补肝肾之功，治疗乳腺癌肝肾亏虚证。因乳腺癌易发生骨转移，也可提前加入以护骨补肾，“先安未受邪之地”。 3.3 机制探讨 中药具有多成分，多靶点，多种调节方式的特点[10]，中药复方的起效机制也是一个复杂多系统、多靶点的综合调控网络，以西方单一靶标和单一成分的研究方法难以反映中药的系统性，不能科学地解释中草药复方的物质基础和处方规律[11]。肿瘤作为一种系统性复杂疾病，我们认为中药复方在防止肿瘤复发转移的过程中必然通过多途径、多靶点协同干预起效。李杰教授巩固治疗乳腺癌的核心处方基于算法分析组合而成，遣方用药具有一定代表性，我们进一步通过网络药理学的方法对核心处方治疗乳腺癌术后的起效机制进行探讨与分析，得到的富集通路大致可分为以下4类。1）激素水平调节：乳腺癌为典型的激素依赖性肿瘤，雌激素和雌激素受体（ER）是其发展转移的重要途径，雌激素不平衡会导致雌激素代谢形成不稳定DNA加合物，从而导致乳腺癌的发生[12]。而雌激素受体被激活时负责许多下游信号通路的介导如PI3K/AKT/mTOR、Ras/Raf/MAPK，这些通路起着促进癌症发展的转录因子的作用[13-14]。催乳素可参与应激反应，促进细胞的增殖和分裂[15]，血清催乳素水平高的患者相对具有较差的预后因子[16]，催乳素主要通过PRLR-JAK/STAT5信号通路介导，并与受体结合诱导受体二聚化和JAK2激活，调控基因的转录，促进肿瘤分化和降低内分泌治疗敏感性[17]。核心处方通过作用于雌激素和催乳素信号通路，可能通过竞争性抑制雌激素，减少雌激素的代谢而降低乳腺癌的复发，通过抑制催乳素增强乳腺癌细胞对内分泌药物的敏感性，减少耐药的发生。2）血管生成和肿瘤微环境：血管内皮生长因子（VEGF）具有刺激血管生成、增加血管通透性，产生白细胞黏附作用。相关医学研究证实，VEGF的产生在极大程度上改变周围血管及胞外基质，为乳腺原位癌演变成浸润癌、乳腺癌向淋巴结转移提供良好的生长条件。低氧是驱动肿瘤转移性进展的一个重要微环境因素，可直接上调葡萄糖转运、血管生成、厌氧代谢、细胞成活、侵袭、转移相关基因的表达使细胞适应缺氧环境[18-19]，HIF-1是低氧诱导转录因子，可影响转移信号通路的多个步骤，促进肿瘤细胞的上皮细胞-间充质转化（EMT），上调血管生成素样蛋白，诱导VEGF、血管生成素2等支持肿瘤细胞转移[20]。核心处方的作用机制可能为干扰VEGF信号通路，降低或阻断肿瘤血管血流，使异常的肿瘤血管趋于正常，调整低氧的肿瘤微循环使之趋于“正常化”，消除潜在的癌变细胞，发挥重要的抑制乳腺癌细胞作用。3）细胞增殖、坏死、凋亡：前20位通路富集结果中有7条通路涉及乳腺癌细胞的增殖和凋亡。ErbB信号通路与生长因子受体家族息息相关，其通路的持续性激活导致了癌基因或通路偏好性肿瘤的发生。核因子κB是參与细胞应答外源刺激的转录调控的转录因子，在肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或白细胞介素（ILs）等细胞信号激活后，IκB激酶复合体发生活化，引起IκB蛋白磷酸化和进一步泛素化降解，降解暴露核因子κB核定位信号，核因子κB形成同源二聚体或异源二聚体参与多种病理生理过程的基因表达，影响细胞增殖和凋亡[21]。在PI3K-AKT信号通路中，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）激活后可催化3，4-二磷酸磷脂酰（肌醇CPIP2）转化为3，4，5三磷酸磷脂酰（肌醇CPIP3），后者作为第二信使参与AKT激活[22]。AKT通过磷酸化抑制BAD、Caspase 9和FOXO1转录因子发挥调控抗凋亡作用，其中BAD可以负调控抗凋亡蛋白BCL-X，Caspase 9属于促凋亡蛋白酶，FOXO1转录因子可调控多种促凋亡基因的表达。此外乳腺癌中ERBB2扩增也会导致AKT活化。AKT通过激活Ikb激酶，上调核因子κB活性，增强细胞增殖并抑制凋亡。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者有4个亚族，p38和JNK通路的激活和细胞凋亡有关，ERK通路在生长因子介导的细胞增殖过程中起重要作用，ERK5在个体生长及肿瘤的发生发展中起桥梁作用[23]。JAK-STAT通路为Janus激酶信号转录激活子信号通路，当STATs被JAKs磷酸化后可引起STAT二聚化、核转位及基因转录的改变[24]。STAT家族中STAT1所调控的相关信号通路更倾向于促进细胞的凋亡并且起到抑制细胞增殖的能力，而STAT3信号通路则与乳腺癌细胞的生长增殖有着密切的联系[25]。肿瘤坏死因子信号通路中，TNF可以调控核因子κB和JNK通路，二者的平衡调控细胞增殖和成活。由此可见，核心处方可通过ERBB、FOXO、核因子κB、PI3K-AKT、MAPK、Jak-STAT、肿瘤坏死因子等以上多种通路影响肿瘤细胞的增殖，导致肿瘤细胞坏死、凋亡，一定程度降低乳腺癌复发转移率。4）炎症反应和免疫应答：微环境中慢性炎症的持续存在对启动、维持和促进肿瘤生长具有重要意义，Th17细胞是最早参与抗感染免疫的效应性T细胞，IL-17是其产生的炎症介质，与炎症反应、免疫应答、免疫排斥相关[26]。慢性炎症可直接影响与Th17分化和IL-17的产生都有关的STAT信号通路，从而促进肿瘤形成。T细胞具有强大的杀伤肿瘤作用，通过细胞毒性T淋巴细胞（CTL）直接发挥作用或通过多种CD4+T细胞依赖的效应机制间接发挥作用。Toll样受体（TLRs）参与识别病原体相关分子模式，介导免疫细胞的激活，在机体固有免疫中起重要作用，TLR2和TLR4能够诱导炎症反应的发生，通过炎症反应微环境的产生进而促进肿瘤的形成[27]。核心处方通过T细胞、Th17、IL-17、Toll样受体等信号通路提高免疫应答活化的可能，激活机体的免疫系统从而杀伤肿瘤细胞。
本研究基于中医传承辅助平台（V2.5），深入挖掘李杰教授临证高频药物和处方规律，对乳腺癌病-方-药之间的内在联系进行了有益探索，以核心处方为落脚点，基于网络药理学分析处方可能的作用机制。李杰教授在辨病、辨证、辨症与辨体质时空结合的四位一体观和“固本清源”、疏肝健脾的治疗指导下的核心处方针对乳腺癌的细胞增殖、坏死，激素调节，血管生成与肿瘤微环境，炎症与免疫等多靶点、多成分、多通路起效，但仍需配合进一步的相关实验验证和阐述。本研究结果为我们进一步挖掘乳腺癌的新方新药提供一定思路和方法，也为基础和临床研究提供了线索和依据。 参考文献
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（2020-04-06收稿 责任编辑：杨觉雄）
基金项目：国家自然科学基金项目（81774289）——基于细胞焦亡通路探讨疏肝健脾方调控乳腺癌MDSC-NKT细胞免疫编辑机制研究
作者简介：吴静远（1996.04—），女，硕士研究生在读，研究方向：中医药干预肿瘤复发转移的研究，E-mail：[email protected]
通信作者：李杰（1971.06—），男，博士，主任医师，博士研究生导师，研究方向：中医药干预肿瘤复发转移的研究，E-mail：[email protected]