论文部分内容阅读
摘要：目的 建立龙胆泻肝胶囊及龙胆泻肝软胶囊的质量标准。方法 采用薄层色谱法对龙胆、柴胡、黄芩、栀子、泽泻、当归、地黄、甘草进行定性鉴别，并采用高效液相色谱法测定龙胆中龙胆苦苷、栀子中栀子苷、黄芩中黄芩苷的含量。结果 薄层色谱斑点清晰。龙胆苦苷在0.066 1～0.595 1 mg范围内呈良好的线性关系（r=1.000 0），胶囊剂平均回收率为99.34%（RSD=1.50%），软胶囊剂平均回收率为96.62%（RSD=1.50%）；栀子苷在0.076 1～1.369 8 mg范围内呈良好的线性关系（r=0.999 9），胶囊剂平均回收率为101.32%（RSD=1.70%），软胶囊剂平均回收率为100.59%（RSD=0.79%）；黄芩苷在0.214 4～1.608 mg范围内呈良好的线性关系（r=1.000 0），胶囊剂平均回收率为101.12%（RSD=1.30%），软胶囊剂平均回收率为98.07%（RSD=2.40%）。结论 该方法简便易行，重复性好，可用于龙胆泻肝胶囊、龙胆泻肝软胶囊的质量控制。
关键词：龙胆泻肝胶囊；龙胆泻肝软胶囊；龙胆苦苷；栀子苷；黄芩苷；薄层色谱法；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）10-0054-06
龙胆泻肝胶囊收载于《卫生部药品标准》新药转正标准第62册，标准号为WS3-343（Z-031）-2003（Z）及仿制生产标准国家药品标准（试行）YBZ06152005，原标准收载了龙胆苦苷的液相色谱鉴别，柴胡、黄芩、当归、甘草的薄层色谱鉴别和高效液相色谱法（HPLC）测定龙胆中龙胆苦苷、栀子中栀子苷的含量[1]。龙胆泻肝软胶囊收载于《卫生部药品标准》新药转正标准第70册，标准号为WS3-816（Z-229）-2005（Z），原标准收载了黄芩苷、龙胆苦苷、栀子苷、甘草次酸的薄层色谱鉴别和HPLC测定黄芩中黄芩苷的含量[2]。为控制药品的内在质量及系列标准的统一，本研究对处方中龙胆、柴胡、黄芩、栀子、泽泻、当归、地黄、甘草进行薄层色谱鉴别，并采用HPLC测定制剂中
1 仪器与试药
岛津LC-20A高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器（PDA）型；硅胶G预制板（烟台市化学工业研究所）；硅胶G预制板（青岛海洋化工厂分厂）。
对照品黄芩苷（批号110715-200212）、龙胆苦苷（批号110703-200322）、栀子苷（批号110749-200714）、甘草苷（批号111610-200604）、阿魏酸（批号0773-9910），对照药材柴胡（批号120992-200705）、泽泻（批号121081-200302）、地黄（批号121180-200402），均购于中国食品药品检定研究院。
龙胆泻肝胶囊样品来自2家生产企业共7批：A（批号20090902、20100603、20100604），B（批号100902、100903、101001、101002）；龙胆泻肝软胶囊样品来自1家生产企业共3批：C（11112211、11112212、11112213）。除B企业生产的101001批次为0.5 g/粒，其他批次均为0.25 g/粒。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 薄层色谱鉴别
2.1 龙胆、栀子、甘草
取龙胆泻肝胶囊及软胶囊内容物各2 g，加甲醇20 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。分别取不含龙胆、栀子、甘草的阴性制剂各2 g，分别同法制成龙胆、栀子及甘草的阴性溶液。另取龙胆苦苷对照品、栀子苷对照品、甘草苷对照品，分别加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述供试品溶液、对照品溶液及阴性溶液各2 ?L，分别点于同一高效硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-水（6∶6∶1）为展开剂，展开2次，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与龙胆苦苷对照品、栀子苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；缺龙胆、栀子的阴性样品无相应斑点。再喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与甘草苷对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；缺甘草阴性样品无相应斑点。
2.2 柴胡
取龙胆泻肝胶囊及软胶囊内容物各5 g，加甲醇60 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次15 mL，合并乙醚液备用。水液用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次15 mL，合并正丁醇液，用5%碳酸钠溶液洗涤3次，每次10 mL，再用水10 mL洗涤，分取正丁醇液，蒸干，残渣加水10 mL使溶解，加于已处理好的D101型大孔吸附树脂柱（柱高为10 cm，内径为15 mm）上，用水50 mL洗涤，再用70%乙醇60 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，加中性氧化铝1 g拌匀，挥干，置中性氧化铝柱（100～200目， 4 g，内径15 mm）上，用甲醇-乙酸乙酯（1∶1）的混合液10 mL洗涤，再用60%甲醇60 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含柴胡的阴性制剂5 g，同法制成柴胡阴性溶液。另取柴胡对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。吸取上述供试品、对照药材及阴性溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-正丁醇-甲醇-水（30∶1∶10∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。缺柴胡阴性样品无相应斑点。
2.3 黄芩 取不含黄芩的阴性制剂2 g，加甲醇20 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为黄芩阴性溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取对照品溶液、阴性溶液及“2.1”项下供试品溶液各3 ?L，以乙酸乙酯-甲酸-水（7∶4∶3）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。缺黄芩阴性样品无相应斑点。
2.4 泽泻
取龙胆泻肝胶囊10 g，加石油醚（60～90 ℃）50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加石油醚（60～90 ℃）1 mL使溶解，作为胶囊剂供试品溶液。另取不含泽泻的胶囊剂阴性制剂10 g，同法制成胶囊剂泽泻阴性溶液。龙胆泻肝软胶囊直接吸取“2.1”项下软胶囊剂供试品溶液。另取不含泽泻的软胶囊阴性制剂2 g，按“2.1”项下制成软胶囊泽泻阴性溶液。另取泽泻对照药材1 g，加石油醚（60～90 ℃）50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加石油醚（60～90 ℃）1 mL使溶解，作为对照药材溶液。吸取上述供试品、对照药材及阴性溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸（15∶2∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。缺泽泻阴性样品无相应斑点。
2.5 当归
取“2.2”项下乙醚液，用2%碳酸钠溶液30 mL振摇提取，分取水层，缓缓加入稀盐酸，调节pH值至1，用乙醚30 mL振摇提取，分取乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取不含当归的阴性制剂5 g，加甲醇60 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次15 mL，合并乙醚液，同法制成当归阴性溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述供试品溶液、对照品溶液及阴性溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-冰醋酸（6∶5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。缺当归阴性样品无相应斑点。
2.6 地黄
取龙胆泻肝胶囊内容物10 g，加乙酸乙酯50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为胶囊剂供试品溶液。取不含地黄的胶囊剂阴性制剂10 g，同法制成胶囊剂地黄阴性溶液。龙胆泻肝软胶囊直接吸取“2.1”项下软胶囊剂供试品溶液。另取不含地黄的软胶囊阴性制剂2 g，按“2.1”项下方法制成软胶囊地黄阴性溶液。另取地黄对照药材1 g，加乙酸乙酯50mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为对照药材溶液。吸取上述供试品溶液、对照药材溶液及阴性溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二甲苯-乙酸乙酯（3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。缺地黄阴性样品无相应斑点。
3 含量测定
3.1 色谱条件
色谱柱：Phenomenex Luna C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按表1、表2进行梯度洗脱；柱温为30 ℃[4]；龙胆苦苷检测波长为270 nm，栀子苷检测波长为238 nm，黄芩苷检测波长为280 nm。理论板数按龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷峰计算均应不低于3000[5-11]。
3.2 对照品溶液的制备
取龙胆苦苷对照品、栀子苷对照品和黄芩苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL含龙胆苦苷30 ?g、栀子苷35 ?g、黄芩苷65 ?g的溶液，即得（胶囊剂测定用）。分别加甲醇制成每1 mL含龙胆苦苷20 ?g、栀子苷20 ?g、黄芩苷65 ?g的溶液，即得（软胶囊剂测定用）。
3.3 供试品溶液的制备
龙胆泻肝胶囊剂内容物混匀，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。龙胆泻肝软胶囊剂内容物混匀，取约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流60 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.4 阴性对照溶液的制备
分别按处方比例及制剂制备工艺制备不含龙胆苦苷、栀子、黄芩苷的阴性样品，再按“3.3”项下方法制备，即得。
3.5 专属性试验
取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 ?L，分别注入液相色谱仪，依法测定，结果龙胆苦苷、栀子、黄芩苷阴性样品分别在龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷相应保留时间处未见色谱峰，表明阴性样品对检测无干扰。见图1～图3。
3.6 线性关系考察
分别精密吸取龙胆苦苷对照品溶液（浓度为0.033 06 mg/mL） 2、3、4、6、8、9、10、12、15、18 ?L，栀子苷对照品溶液（浓度为0.076 1 mg/mL）1、2、3、4、5、6、8、9、10、12、15、18 ?L，黄芩苷对照品溶液（浓度为0.107 2 mg/mL）2、4、6、8、12、15 ?L，注入高效液相色谱仪，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程。龙胆苦苷为Y=1 320 942.996 28X+942.533 52（r=1.000 0），表明其在0.066 12～0.595 1 ?g范围内线性关系良好；栀子苷为Y=1 554 982.041 17X+537.38788（r=0.999 9），表明其在0.076 1～1.369 8 ?g范围内线性关系良好；黄芩苷为Y=3 595 816.662 38X+14494.72138（r=1.000 0），表明其在0.214 4～1.608 ?g范围内线性关系良好。 3.7 稳定性试验
取同一份供试品溶液（胶囊剂批号100902，软胶囊剂批号11112211），按含量测定方法，分别在胶囊剂制备后0、4、8、12、16、20、24 h进样测定，软胶囊剂在配置后0、2、4、6、10、14 h进样测定。胶囊剂峰面积RSD龙胆苦苷为0.84%，栀子苷为0.50%，黄芩苷为0.68%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。软胶囊剂峰面积RSD龙胆苦苷为0.84%，栀子苷为0.51%，黄芩苷为0.49%，表明供试品溶液在14 h内基本稳定。
3.8 重复性试验
分别取胶囊剂内容物约0.5 g及软胶囊剂内容物约0.3 g，精密称定，依法测定。胶囊剂含量RSD龙胆苦苷为0.56%，栀子苷为0.29%，黄芩苷为0.11%，方法重复性良好。软胶囊剂含量RSD龙胆苦苷为0.16%，栀子苷为0.64%，黄芩苷为0.56%，方法重复性良好。
3.9 龙胆泻肝胶囊加样回收率试验
采用加样回收法，设计3个浓度，每个浓度各制备3份供试品溶液。精密称取已知含量同一批样品（批号100902，龙胆苦苷含量为3.584 4 mg/g，栀子苷含量为6.480 6 mg/g，黄芩苷含量为7.764 6 mg/g）：①（低浓度）取0.125 g，精密加入对照品混合溶液（含龙胆苦苷0.007 065 mg/mL，栀子苷0.008 965 mg/mL，黄芩苷0.016 355 mg/mL）50 mL；②（中浓度）取0.25 g，精密加入对照品混合溶液（含龙胆苦苷0.014 13 mg/mL，栀子苷0.017 93 mg/mL，黄芩苷0.032 71 mg/mL）50 mL；③（高浓度）取0.5 g，精密加入对照品混合溶液（含龙胆苦苷0.028 26 mg/mL，栀子苷0.035 86 mg/mL，黄芩苷0.065 42 mg/mL）50 mL。分别按“3.3”项下方法制备并测定。结果龙胆苦苷平均回收率为99.34%，RSD=1.50%；栀子苷平均回收率为101.32%，RSD=1.70%；黄芩苷平均回收率为101.12%，RSD=1.30%。见表3～表5。
3.10 龙胆泻肝软胶囊加样回收率试验
采用加样回收法，设计3个浓度，各制备3份供试品溶液。精密称取已知含量的同一批样品（批号11112212，龙胆苦苷4.842 4 mg/g，栀子苷4.435 5 mg/g，黄芩苷11.601 1 mg/g）：①（低浓度）取本品约0.075 g，精密加入对照品混合溶液（含龙胆苦苷0.007 495 mg/mL，栀子苷0.006 945 mg/mL，黄芩苷0.016 605 mg/mL）50 mL；②（中浓度）取本品约0.15 g精密加入对照品混合溶液（含龙胆苦苷0.014 99 mg/mL，栀子苷0.013 89 mg/mL，黄芩苷0.033 21 mg/mL）50 mL；③（高浓度）取约0.30 g精密加入对照品混合溶液（含龙胆苦苷0.029 98 mg/mL，栀子苷0.027 78 mg/mL，黄芩苷0.06642 mg/mL） 50 mL按供试品溶液同法制备，测定。结果见表6～表8。
3.11 样品测定
按上述测定方法，测定7批龙胆泻肝胶囊和3批龙胆泻肝软胶囊样品，结果见表9。
4 讨论
龙胆泻肝胶囊及龙胆泻肝软胶囊处方由10味药构成，本研究共进行了8味药的薄层色谱鉴别研究，仅木通及车前子未能购买到中国药品生物制品检定所提供对照药材，故未进行研究。
龙胆苦苷、栀子苷、甘草苷的薄层鉴别中，由于3种成分较难分离，经过大量试验，最终确定用高效薄层板，以同一展开剂展开2次的方法进行分离，得到了较理想的结果。
本研究的6个薄层色谱耐用性考察结果表明，采用不同薄层板，在不同温度和湿度条件下，均获得较好的薄层色谱分离。
本研究采用同一样品，分别在其最大吸收波长下，同时测定3种成分的含量，前处理简单，试验操作简便，可较大节省试验中的人力及物力消耗。
本研究选用甲醇、80%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、无水乙醇、80%乙醇、稀乙醇、30%乙醇共8种溶剂对各成分的提取效率进行了比较，龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷在50%甲醇中均有较好的提取效率，故选择50%甲醇作为测定样品的提取溶剂。采用超声提取10、20、30、40、50 min及加热回流提取20、40、60、90 min共9种方法对提取效率进行了考察，结果认为选择超声处理40 min为宜。
分别采用不同品牌色谱柱Phenomenex luna C18（5 ?m， 250 mm×4.6 mm）、TechMate C18（5 ?m，250 mm×4.6 mm）、Kromasil 100-5C18 （5 ?m，250 mm×4.6 mm）进行测定，结果龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷峰分别在各种色谱柱均分离良好，空白无干扰，不同色谱柱间测定，龙胆泻肝胶囊中龙胆苦苷含量RSD=1.6%，栀子苷含量RSD=1.4%，黄芩苷含量RSD=0.81%；龙胆泻肝软胶囊中龙胆苦苷含量RSD=1.3%，栀子苷含量RSD=0.77%，黄芩苷含量RSD=1.8%，表明本方法耐用性较好。
参考文献：
[1] 国家食品药品监督管理局.国家药品标准新药转正标准：第62册[S].北京：人民卫生出版社，2008.
[2] 国家食品药品监督管理局.国家药品标准新药转正标准：第70册[S].北京：人民卫生出版社，2008.
[3] 郑小平，申丽莎.龙胆泻肝片的薄层鉴别方法[J].中国药业，2008，7（16）：39-40.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：7.
[5] 李春红，梅志强，何兵，等.HPLC同时测定龙胆泻肝制剂中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量[J].生物学通报，2012，47（4）：60-62.
[6] 王晓雷.高效液相色谱法测定龙胆泻肝丸中黄芩苷的含量[J].中国医药导报，2009，6（10）：66-67.
[7] 金齐武，张青云，蒲婧哲.HPLC法测定龙胆泻肝丸（水丸）中栀子苷的含量[J].安徽医药，2008，12（7）：604-605.
[8] 冯亦颖，王巨存，徐学锐.高效液相色谱法测定龙胆泻肝丸中栀子苷的含量[J].天津药学，2008，20（3）：11-13.
[9] 刘天柱，莫结丽.HPLC法测定龙胆泻肝片中栀子苷的含量[J].中国医药导报，2008，5（10）：34-35.
[10] 冯亦颖，王巨存，徐学锐.HPLC法测定龙胆泻肝丸中黄芩苷的含量[J].天津药学，2007，19（5）：64-66.
[11] 刘瑞新.HPLC同时测定龙胆泻肝丸中龙胆苦苷和栀子苷的含量[J].中成药，2007，29（8）：1170-1172.
（收稿日期：2013-01-28，编辑：陈静）
关键词：龙胆泻肝胶囊；龙胆泻肝软胶囊；龙胆苦苷；栀子苷；黄芩苷；薄层色谱法；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）10-0054-06
龙胆泻肝胶囊收载于《卫生部药品标准》新药转正标准第62册，标准号为WS3-343（Z-031）-2003（Z）及仿制生产标准国家药品标准（试行）YBZ06152005，原标准收载了龙胆苦苷的液相色谱鉴别，柴胡、黄芩、当归、甘草的薄层色谱鉴别和高效液相色谱法（HPLC）测定龙胆中龙胆苦苷、栀子中栀子苷的含量[1]。龙胆泻肝软胶囊收载于《卫生部药品标准》新药转正标准第70册，标准号为WS3-816（Z-229）-2005（Z），原标准收载了黄芩苷、龙胆苦苷、栀子苷、甘草次酸的薄层色谱鉴别和HPLC测定黄芩中黄芩苷的含量[2]。为控制药品的内在质量及系列标准的统一，本研究对处方中龙胆、柴胡、黄芩、栀子、泽泻、当归、地黄、甘草进行薄层色谱鉴别，并采用HPLC测定制剂中
1 仪器与试药
岛津LC-20A高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器（PDA）型；硅胶G预制板（烟台市化学工业研究所）；硅胶G预制板（青岛海洋化工厂分厂）。
对照品黄芩苷（批号110715-200212）、龙胆苦苷（批号110703-200322）、栀子苷（批号110749-200714）、甘草苷（批号111610-200604）、阿魏酸（批号0773-9910），对照药材柴胡（批号120992-200705）、泽泻（批号121081-200302）、地黄（批号121180-200402），均购于中国食品药品检定研究院。
龙胆泻肝胶囊样品来自2家生产企业共7批：A（批号20090902、20100603、20100604），B（批号100902、100903、101001、101002）；龙胆泻肝软胶囊样品来自1家生产企业共3批：C（11112211、11112212、11112213）。除B企业生产的101001批次为0.5 g/粒，其他批次均为0.25 g/粒。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 薄层色谱鉴别
2.1 龙胆、栀子、甘草
取龙胆泻肝胶囊及软胶囊内容物各2 g，加甲醇20 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。分别取不含龙胆、栀子、甘草的阴性制剂各2 g，分别同法制成龙胆、栀子及甘草的阴性溶液。另取龙胆苦苷对照品、栀子苷对照品、甘草苷对照品，分别加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述供试品溶液、对照品溶液及阴性溶液各2 ?L，分别点于同一高效硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-水（6∶6∶1）为展开剂，展开2次，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与龙胆苦苷对照品、栀子苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；缺龙胆、栀子的阴性样品无相应斑点。再喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与甘草苷对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；缺甘草阴性样品无相应斑点。
2.2 柴胡
取龙胆泻肝胶囊及软胶囊内容物各5 g，加甲醇60 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次15 mL，合并乙醚液备用。水液用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次15 mL，合并正丁醇液，用5%碳酸钠溶液洗涤3次，每次10 mL，再用水10 mL洗涤，分取正丁醇液，蒸干，残渣加水10 mL使溶解，加于已处理好的D101型大孔吸附树脂柱（柱高为10 cm，内径为15 mm）上，用水50 mL洗涤，再用70%乙醇60 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，加中性氧化铝1 g拌匀，挥干，置中性氧化铝柱（100～200目， 4 g，内径15 mm）上，用甲醇-乙酸乙酯（1∶1）的混合液10 mL洗涤，再用60%甲醇60 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含柴胡的阴性制剂5 g，同法制成柴胡阴性溶液。另取柴胡对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。吸取上述供试品、对照药材及阴性溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-正丁醇-甲醇-水（30∶1∶10∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。缺柴胡阴性样品无相应斑点。
2.3 黄芩 取不含黄芩的阴性制剂2 g，加甲醇20 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为黄芩阴性溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取对照品溶液、阴性溶液及“2.1”项下供试品溶液各3 ?L，以乙酸乙酯-甲酸-水（7∶4∶3）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。缺黄芩阴性样品无相应斑点。
2.4 泽泻
取龙胆泻肝胶囊10 g，加石油醚（60～90 ℃）50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加石油醚（60～90 ℃）1 mL使溶解，作为胶囊剂供试品溶液。另取不含泽泻的胶囊剂阴性制剂10 g，同法制成胶囊剂泽泻阴性溶液。龙胆泻肝软胶囊直接吸取“2.1”项下软胶囊剂供试品溶液。另取不含泽泻的软胶囊阴性制剂2 g，按“2.1”项下制成软胶囊泽泻阴性溶液。另取泽泻对照药材1 g，加石油醚（60～90 ℃）50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加石油醚（60～90 ℃）1 mL使溶解，作为对照药材溶液。吸取上述供试品、对照药材及阴性溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸（15∶2∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。缺泽泻阴性样品无相应斑点。
2.5 当归
取“2.2”项下乙醚液，用2%碳酸钠溶液30 mL振摇提取，分取水层，缓缓加入稀盐酸，调节pH值至1，用乙醚30 mL振摇提取，分取乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取不含当归的阴性制剂5 g，加甲醇60 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次15 mL，合并乙醚液，同法制成当归阴性溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述供试品溶液、对照品溶液及阴性溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-冰醋酸（6∶5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。缺当归阴性样品无相应斑点。
2.6 地黄
取龙胆泻肝胶囊内容物10 g，加乙酸乙酯50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为胶囊剂供试品溶液。取不含地黄的胶囊剂阴性制剂10 g，同法制成胶囊剂地黄阴性溶液。龙胆泻肝软胶囊直接吸取“2.1”项下软胶囊剂供试品溶液。另取不含地黄的软胶囊阴性制剂2 g，按“2.1”项下方法制成软胶囊地黄阴性溶液。另取地黄对照药材1 g，加乙酸乙酯50mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为对照药材溶液。吸取上述供试品溶液、对照药材溶液及阴性溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二甲苯-乙酸乙酯（3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。缺地黄阴性样品无相应斑点。
3 含量测定
3.1 色谱条件
色谱柱：Phenomenex Luna C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按表1、表2进行梯度洗脱；柱温为30 ℃[4]；龙胆苦苷检测波长为270 nm，栀子苷检测波长为238 nm，黄芩苷检测波长为280 nm。理论板数按龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷峰计算均应不低于3000[5-11]。
3.2 对照品溶液的制备
取龙胆苦苷对照品、栀子苷对照品和黄芩苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL含龙胆苦苷30 ?g、栀子苷35 ?g、黄芩苷65 ?g的溶液，即得（胶囊剂测定用）。分别加甲醇制成每1 mL含龙胆苦苷20 ?g、栀子苷20 ?g、黄芩苷65 ?g的溶液，即得（软胶囊剂测定用）。
3.3 供试品溶液的制备
龙胆泻肝胶囊剂内容物混匀，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。龙胆泻肝软胶囊剂内容物混匀，取约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流60 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.4 阴性对照溶液的制备
分别按处方比例及制剂制备工艺制备不含龙胆苦苷、栀子、黄芩苷的阴性样品，再按“3.3”项下方法制备，即得。
3.5 专属性试验
取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 ?L，分别注入液相色谱仪，依法测定，结果龙胆苦苷、栀子、黄芩苷阴性样品分别在龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷相应保留时间处未见色谱峰，表明阴性样品对检测无干扰。见图1～图3。
3.6 线性关系考察
分别精密吸取龙胆苦苷对照品溶液（浓度为0.033 06 mg/mL） 2、3、4、6、8、9、10、12、15、18 ?L，栀子苷对照品溶液（浓度为0.076 1 mg/mL）1、2、3、4、5、6、8、9、10、12、15、18 ?L，黄芩苷对照品溶液（浓度为0.107 2 mg/mL）2、4、6、8、12、15 ?L，注入高效液相色谱仪，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程。龙胆苦苷为Y=1 320 942.996 28X+942.533 52（r=1.000 0），表明其在0.066 12～0.595 1 ?g范围内线性关系良好；栀子苷为Y=1 554 982.041 17X+537.38788（r=0.999 9），表明其在0.076 1～1.369 8 ?g范围内线性关系良好；黄芩苷为Y=3 595 816.662 38X+14494.72138（r=1.000 0），表明其在0.214 4～1.608 ?g范围内线性关系良好。 3.7 稳定性试验
取同一份供试品溶液（胶囊剂批号100902，软胶囊剂批号11112211），按含量测定方法，分别在胶囊剂制备后0、4、8、12、16、20、24 h进样测定，软胶囊剂在配置后0、2、4、6、10、14 h进样测定。胶囊剂峰面积RSD龙胆苦苷为0.84%，栀子苷为0.50%，黄芩苷为0.68%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。软胶囊剂峰面积RSD龙胆苦苷为0.84%，栀子苷为0.51%，黄芩苷为0.49%，表明供试品溶液在14 h内基本稳定。
3.8 重复性试验
分别取胶囊剂内容物约0.5 g及软胶囊剂内容物约0.3 g，精密称定，依法测定。胶囊剂含量RSD龙胆苦苷为0.56%，栀子苷为0.29%，黄芩苷为0.11%，方法重复性良好。软胶囊剂含量RSD龙胆苦苷为0.16%，栀子苷为0.64%，黄芩苷为0.56%，方法重复性良好。
3.9 龙胆泻肝胶囊加样回收率试验
采用加样回收法，设计3个浓度，每个浓度各制备3份供试品溶液。精密称取已知含量同一批样品（批号100902，龙胆苦苷含量为3.584 4 mg/g，栀子苷含量为6.480 6 mg/g，黄芩苷含量为7.764 6 mg/g）：①（低浓度）取0.125 g，精密加入对照品混合溶液（含龙胆苦苷0.007 065 mg/mL，栀子苷0.008 965 mg/mL，黄芩苷0.016 355 mg/mL）50 mL；②（中浓度）取0.25 g，精密加入对照品混合溶液（含龙胆苦苷0.014 13 mg/mL，栀子苷0.017 93 mg/mL，黄芩苷0.032 71 mg/mL）50 mL；③（高浓度）取0.5 g，精密加入对照品混合溶液（含龙胆苦苷0.028 26 mg/mL，栀子苷0.035 86 mg/mL，黄芩苷0.065 42 mg/mL）50 mL。分别按“3.3”项下方法制备并测定。结果龙胆苦苷平均回收率为99.34%，RSD=1.50%；栀子苷平均回收率为101.32%，RSD=1.70%；黄芩苷平均回收率为101.12%，RSD=1.30%。见表3～表5。
3.10 龙胆泻肝软胶囊加样回收率试验
采用加样回收法，设计3个浓度，各制备3份供试品溶液。精密称取已知含量的同一批样品（批号11112212，龙胆苦苷4.842 4 mg/g，栀子苷4.435 5 mg/g，黄芩苷11.601 1 mg/g）：①（低浓度）取本品约0.075 g，精密加入对照品混合溶液（含龙胆苦苷0.007 495 mg/mL，栀子苷0.006 945 mg/mL，黄芩苷0.016 605 mg/mL）50 mL；②（中浓度）取本品约0.15 g精密加入对照品混合溶液（含龙胆苦苷0.014 99 mg/mL，栀子苷0.013 89 mg/mL，黄芩苷0.033 21 mg/mL）50 mL；③（高浓度）取约0.30 g精密加入对照品混合溶液（含龙胆苦苷0.029 98 mg/mL，栀子苷0.027 78 mg/mL，黄芩苷0.06642 mg/mL） 50 mL按供试品溶液同法制备，测定。结果见表6～表8。
3.11 样品测定
按上述测定方法，测定7批龙胆泻肝胶囊和3批龙胆泻肝软胶囊样品，结果见表9。
4 讨论
龙胆泻肝胶囊及龙胆泻肝软胶囊处方由10味药构成，本研究共进行了8味药的薄层色谱鉴别研究，仅木通及车前子未能购买到中国药品生物制品检定所提供对照药材，故未进行研究。
龙胆苦苷、栀子苷、甘草苷的薄层鉴别中，由于3种成分较难分离，经过大量试验，最终确定用高效薄层板，以同一展开剂展开2次的方法进行分离，得到了较理想的结果。
本研究的6个薄层色谱耐用性考察结果表明，采用不同薄层板，在不同温度和湿度条件下，均获得较好的薄层色谱分离。
本研究采用同一样品，分别在其最大吸收波长下，同时测定3种成分的含量，前处理简单，试验操作简便，可较大节省试验中的人力及物力消耗。
本研究选用甲醇、80%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、无水乙醇、80%乙醇、稀乙醇、30%乙醇共8种溶剂对各成分的提取效率进行了比较，龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷在50%甲醇中均有较好的提取效率，故选择50%甲醇作为测定样品的提取溶剂。采用超声提取10、20、30、40、50 min及加热回流提取20、40、60、90 min共9种方法对提取效率进行了考察，结果认为选择超声处理40 min为宜。
分别采用不同品牌色谱柱Phenomenex luna C18（5 ?m， 250 mm×4.6 mm）、TechMate C18（5 ?m，250 mm×4.6 mm）、Kromasil 100-5C18 （5 ?m，250 mm×4.6 mm）进行测定，结果龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷峰分别在各种色谱柱均分离良好，空白无干扰，不同色谱柱间测定，龙胆泻肝胶囊中龙胆苦苷含量RSD=1.6%，栀子苷含量RSD=1.4%，黄芩苷含量RSD=0.81%；龙胆泻肝软胶囊中龙胆苦苷含量RSD=1.3%，栀子苷含量RSD=0.77%，黄芩苷含量RSD=1.8%，表明本方法耐用性较好。
参考文献：
[1] 国家食品药品监督管理局.国家药品标准新药转正标准：第62册[S].北京：人民卫生出版社，2008.
[2] 国家食品药品监督管理局.国家药品标准新药转正标准：第70册[S].北京：人民卫生出版社，2008.
[3] 郑小平，申丽莎.龙胆泻肝片的薄层鉴别方法[J].中国药业，2008，7（16）：39-40.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：7.
[5] 李春红，梅志强，何兵，等.HPLC同时测定龙胆泻肝制剂中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量[J].生物学通报，2012，47（4）：60-62.
[6] 王晓雷.高效液相色谱法测定龙胆泻肝丸中黄芩苷的含量[J].中国医药导报，2009，6（10）：66-67.
[7] 金齐武，张青云，蒲婧哲.HPLC法测定龙胆泻肝丸（水丸）中栀子苷的含量[J].安徽医药，2008，12（7）：604-605.
[8] 冯亦颖，王巨存，徐学锐.高效液相色谱法测定龙胆泻肝丸中栀子苷的含量[J].天津药学，2008，20（3）：11-13.
[9] 刘天柱，莫结丽.HPLC法测定龙胆泻肝片中栀子苷的含量[J].中国医药导报，2008，5（10）：34-35.
[10] 冯亦颖，王巨存，徐学锐.HPLC法测定龙胆泻肝丸中黄芩苷的含量[J].天津药学，2007，19（5）：64-66.
[11] 刘瑞新.HPLC同时测定龙胆泻肝丸中龙胆苦苷和栀子苷的含量[J].中成药，2007，29（8）：1170-1172.
（收稿日期：2013-01-28，编辑：陈静）