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摘要：目的 观察电针血清对β淀粉样蛋白（Aβ）诱导的原代大鼠海马神经元的保护作用。方法 通过Aβ1-40脑内注射建立阿尔茨海默病大鼠模型，予以电针治疗后，留取各组血清。Aβ25-35处理原代培养海马神经元建立体外神经元损伤模型，实验分为正常组、模型组和电针血清组，通过MTT法检测神经元的增殖，采用TUNEL染色法检测神经元的凋亡，通过免疫细胞化学染色检测Caspase-3的表达。结果 MTT检测结果发现，经Aβ处理后，细胞活力显著下降。而与模型组比较，电针血清组细胞增殖能力明显增强（P<0.01）；TUNEL染色结果显示，与模型组比较，电针血清组凋亡细胞数目明显减少（P<0.01）；经Aβ处理48 h后，Caspase-3表达水平明显升高，电针血清组Caspase-3阳性细胞数目较模型组显著减少（P<0.01）。结论 电针血清能促进海马神经元的增殖，降低其Caspase-3 的表达，对抗Aβ的神经毒性，减少神经元的凋亡。
关键词：电针血清；神经元；凋亡；β淀粉样蛋白；阿尔茨海默病；大鼠
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）10-0038-03
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的中枢神经系统退行性变性疾病。其主要特征是记忆丧失、认知缺陷
和严重的精神神经症状。β淀粉样蛋白（β-amyloid protein， Aβ）是各种原因引发的AD的共同通路[1]，Aβ级联学说是目前研究最多的AD的病理机制之一。临床和动物实验均表明，电针治疗对AD具有明显的疗效[2-3]，但其机制目前尚未完全阐明[4]。电针血清是指针灸处理后的动物血清，以其作为效应物质，通过观察培养细胞的形态和分子生物学改变，可从体外实验直接研究针灸的作用机理[5]。本实验从电针血清是否有效降低大鼠海马神经元凋亡的角度进一步探讨电针治疗保护海马神经元和增强学习记忆功能的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
成年SPF级SD大鼠30只（动物合格证号：2008001611157），雄性，体质量350～450 g；出生24 h内SD大鼠20只（动物合格证号：2008001609451），均由上海中医药大学实验动物中心提供。常规饲养，昼夜时间比为1∶1。
1.2 试剂与仪器
Aβ1-40、Aβ25-35（Sigma公司）；TUNEL染色试剂盒、MTT试剂盒（碧云天生物技术研究所）；抗Caspase-3兔单克隆抗体（Santa cruz）；FITC-羊抗兔IgG（Santa cruz）；青霉素、链霉素粉针剂（华北制药集团）；微管相关蛋白2抗体（MAP-2）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自美国cell signaling technology公司。
Morris水迷宫实验系统（Smart Junior，西班牙Panlab公司），脑立体定位仪（中国人民解放军第二军医大学生理教研室），微量注射器（5 ?L，Hamilton，瑞士），G6805A型电针治疗仪（常州英迪电子医疗器械有限公司），孔径0.22 ?m过滤器（Millipore公司），无菌针灸针（0.25 mm×13 mm，吴江市云龙医疗器械有限公司）。
2 实验方法
2.1 造模
10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉后，将成年大鼠头颅固定在脑立体定位仪上，头皮备皮，消毒手术区皮肤，做正中切口暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱，以前囟为原点，向后3.5 mm，旁开2.0 mm为钻孔点，钻开对称2个孔，自脑表面进针3.0 mm至海马，用微量进样器抽取2 ?L Aβ1-40（用无菌生理盐水将其稀释成10 ?g/?L，37℃孵育1周，使其变为聚集状态），缓慢进针，注射速度0.2 ?L/min，注射完毕，停针5 min后，以1.0 mm/min速度缓慢拔针，缝合皮肤，术后肌肉注射青霉素，连续3 d，以防感染。
2.2 分组与治疗
实验分为正常组、模型组和电针组。对照大鼠穴位图谱，以13 mm毫针针灸“百会”（顶骨正中）、“肾俞”（第2腰椎下两旁），连接G6805A型电针治疗仪，选择连续波，频率为20 Hz。针刺治疗每日1次，每次30 min，1周为1个疗程，治疗4个疗程。正常组及模型组正常饲养，不予针刺治疗。在治疗结束后，各组分别在无菌条件下，下腔静脉采血，分离血清，过滤除菌，冰冻保存备用。
2.3 原代海马神经元的培养
出生24 h内SD大鼠，断头取脑，分离出双侧海马组织，消化，吹打后以1×106/mL的密度接种于培养板内。细胞培养7 d后，将其分为正常组、模型组和电针血清组，各组分别更换含有“2.2”项中各组10%血清的培养液，模型组和电针血清组予以 Aβ25-35（26 ?L/mL）处理48 h。
2.4 MTT法检测细胞增殖
用5 mL MTT溶剂溶解25 mg MTT，配制成5 mg/mL MTT溶液。设置调零孔，每孔加入10 ?L MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4 h，使其充分形成紫色结晶。每孔直接加入100 ?L Formanzan溶解液，在细胞培养箱内继续孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现 Formazan全部溶解。在570 nm波长测定吸光度（OD值）。
2.5 免疫组织化学染色
TUNEL染色：取出细胞培养板，免疫染色固定液固定细胞30 min，0.01 mol/L PBS洗涤1次，免疫染色洗涤液清洗1次， 0.01 mol/L PBS洗涤2次，在样品上加50 ?L TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗涤3次，抗荧光淬灭封片液封片后于荧光显微镜下观察并拍照。 Caspase-3免疫细胞化学染色：取出细胞培养板，免疫染色固定液固定细胞20 min，0.01 mol/L PBS洗涤3次，加入免疫染色封闭液，在37 ℃条件下孵育30 min，加入抗Caspase-3兔单克隆抗体，在4 ℃条件下孵育过夜，用PBS浸洗细胞3次，加入FITC-羊抗兔IgG，在37 ℃条件下孵育1 h，PBS洗涤3次，加入Hoechst 33342室温染色10 min，经PBS充分清洗后，缓冲甘油封片后荧光显微镜下观察并计数阳性细胞个数。
3 统计学方法
采用SPSS15.0统计软件进行分析。数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 海马神经元的培养与鉴定
接种后24 h，在倒置显微镜下可见全部细胞已贴壁，且伸出短小的突起。培养7 d后神经元胞体饱满，多呈梭形、锥形，少数呈多边形，细胞的突起进一步增多增长，大部分神经元有2～5个突起，形成神经元网络（见图1）。免疫细胞化学染色显示，培养7 d的大鼠海马神经元NSE和MAP-2抗体标记阳性（见图2）。NSE和MAP-2双标阳性细胞数达90%左右。
4.2 电针血清对神经元增殖的影响
MTT检测结果发现，与正常组比较，模型组细胞活力显著下降（P<0.01），而电针血清组与模型组比较，细胞增殖能力明显增强，差异有统计学意义（P<0.01）。见图3。
4.3 电针血清对神经元存活的影响
经Aβ处理48 h后，细胞发生明显凋亡，部分细胞从皿底脱落，甚至漂浮；与模型组比较，电针血清组凋亡细胞数明显减少（见图4）。通过计数200倍视野下TUNEL阳性细胞个数，经统计学分析发现，模型组和电针血清组凋亡细胞数目显著增多，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01），而电针血清组与模型组比较，凋亡细胞数目明显减少（P<0.01），见图5。
4.4 电针血清对Caspase-3表达的影响
在正常组，Caspase-3 表达水平很低，只有少数细胞表达Caspase-3。经Aβ处理48 h后，Caspase-3 表达水平明显升高，与正常组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。电针血清组也有部分细胞表达Caspase-3，但Caspase-3阳性细胞数目较模型组显著减少（P<0.01）。见表1。
5 讨论
AD在中医学中散见于“郁证”、“癫狂”、“呆病”、“健忘”等证的描述中，其发生和脑、脾、肾关系密切。针灸通过刺激人体特定的腧穴，激发经络之气，调整脏腑、经络及大脑的机能，促进衰退神经元的能量代谢，防治AD。本实验中，百会位于巅顶，通过督脉入络脑，乃局部取穴，以醒脑宁神；肾俞补肾养髓，髓海得充，可健脑益智，从而治疗老年痴呆。然而针灸治疗AD的具体作用机制目前尚未完全阐明。
AD的神经病理特征包括细胞外老年斑和细胞内神经原纤维缠结的产生，以及基底前脑支配海马和皮质的胆碱能神经元的丢失。目前普遍认为有神经毒性的Aβ聚集是AD发生和发展的始动因素[1]，所以AD 治疗主要集中在减少Aβ沉积和阻断具有毒性的Aβ的形成[6]。而海马与学习记忆功能密切相关，因此选用原代培养的海马神经元作为研究针刺治疗AD的作用机制较为理想。
Caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件，其激活与超常表达均引起细胞凋亡，可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡[7]。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，在凋亡的执行阶段，负责对全部或部分关键性蛋白的酶切[8]。我们前期实验表明，电针治疗可以降低大鼠海马区Caspase-3的表达，调控Bcl-2和Bax的表达平衡，维持神经元的存活[9]。而本研究发现，电针血清可以促进体外培养神经元的增殖，并可对抗Aβ诱导的凋亡。由此推测，电针治疗可能通过刺激动物血清成分的变化而发挥保护神经元并改善学习记忆的作用。
最近的研究表明，电针能有效调节帕金森病患者血清中脑源性神经营养因子的水平，从而缓解抑郁症状[8]。也有学者发现，电针肾俞、风府、足三里、三阴交可以提高脑组织和血清超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性，降低丙二醛含量，增强氧自由基清除能力从而发挥对神经元的保护作用[11]。在AD大鼠模型，电针治疗的过程中血清中成分发生什么样的变化，某种或某些神经营养因子的表达和分泌是否提高，值得进一步深入研究。
综上所述，电针血清可以有效降低AD大鼠海马神经元凋亡，而其机制可能是通过降低凋亡执行蛋白Caspase-3的表达，对抗Aβ的神经毒性，发挥对AD海马神经元的保护作用。
参考文献：
[1] Cavallucci V， D'Amelio M， Cecconi F. Aβ toxicity in Alzheimer's disease[J]. Mol Neurobiol，2012，45（2）：366-378.
[2] Cheng HY， Cheng DQ. Progress in research on acupuncture treatment of senile dementia[J]. J Tradit Chin Med，2009，29（3）：224-233.
[3] 蔡涛，肖冬玲.针刺对老年性痴呆患者Hcy、Aβ干预作用的临床观察[J].上海针灸杂志，2008，27（12）：3-5.
[4] 朱晶，国海东，邵水金.针灸治疗阿尔茨海默病机制的研究进展[J].针刺研究，2012，37（5）：422-427.
[5] 邵水金，单宝枝，张建华，等.电针血清对雪旺细胞的影响[J].上海针灸杂志，2000，9（增刊）：58-59.
[6] Barnham KJ， Kenche VB， Ciccotosto GD， et al. Platinum-based inhibitors of amyloid-beta as therapeutic agents for Alzheimer's disease [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（19）：6813-6818.
[7] Kumar S. Caspase function in programmed cell death[J]. Cell Death Differ，2007，14（1）：32-43.
[8] Fuchs Y， Steller H. Programmed cell death in animal development and disease[J]. Cell，2011，147（4）：742-758.
[9] 国海东，邵水金，朱晶，等.电针对阿尔茨海默病大鼠学习记忆力改善及海马神经元损伤保护的作用及机制[J].上海针灸杂志，2012，31（9）：682-685.
[10] 夏毅，王海东，丁莹，等.电针结合药物治疗帕金森伴发抑郁症及对患者血清BDNF的影响[J].中国针灸，2012，32（12）：1071-1074.
[11] 张晓琳，刘智艳，刘娟，等.电针对老年性痴呆大鼠记忆功能减退的影响[J].中华中医药杂志，2012，27（3）：706-708.
（收稿日期：2013-02-21，编辑：华强）
关键词：电针血清；神经元；凋亡；β淀粉样蛋白；阿尔茨海默病；大鼠
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）10-0038-03
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的中枢神经系统退行性变性疾病。其主要特征是记忆丧失、认知缺陷
和严重的精神神经症状。β淀粉样蛋白（β-amyloid protein， Aβ）是各种原因引发的AD的共同通路[1]，Aβ级联学说是目前研究最多的AD的病理机制之一。临床和动物实验均表明，电针治疗对AD具有明显的疗效[2-3]，但其机制目前尚未完全阐明[4]。电针血清是指针灸处理后的动物血清，以其作为效应物质，通过观察培养细胞的形态和分子生物学改变，可从体外实验直接研究针灸的作用机理[5]。本实验从电针血清是否有效降低大鼠海马神经元凋亡的角度进一步探讨电针治疗保护海马神经元和增强学习记忆功能的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
成年SPF级SD大鼠30只（动物合格证号：2008001611157），雄性，体质量350～450 g；出生24 h内SD大鼠20只（动物合格证号：2008001609451），均由上海中医药大学实验动物中心提供。常规饲养，昼夜时间比为1∶1。
1.2 试剂与仪器
Aβ1-40、Aβ25-35（Sigma公司）；TUNEL染色试剂盒、MTT试剂盒（碧云天生物技术研究所）；抗Caspase-3兔单克隆抗体（Santa cruz）；FITC-羊抗兔IgG（Santa cruz）；青霉素、链霉素粉针剂（华北制药集团）；微管相关蛋白2抗体（MAP-2）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自美国cell signaling technology公司。
Morris水迷宫实验系统（Smart Junior，西班牙Panlab公司），脑立体定位仪（中国人民解放军第二军医大学生理教研室），微量注射器（5 ?L，Hamilton，瑞士），G6805A型电针治疗仪（常州英迪电子医疗器械有限公司），孔径0.22 ?m过滤器（Millipore公司），无菌针灸针（0.25 mm×13 mm，吴江市云龙医疗器械有限公司）。
2 实验方法
2.1 造模
10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉后，将成年大鼠头颅固定在脑立体定位仪上，头皮备皮，消毒手术区皮肤，做正中切口暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱，以前囟为原点，向后3.5 mm，旁开2.0 mm为钻孔点，钻开对称2个孔，自脑表面进针3.0 mm至海马，用微量进样器抽取2 ?L Aβ1-40（用无菌生理盐水将其稀释成10 ?g/?L，37℃孵育1周，使其变为聚集状态），缓慢进针，注射速度0.2 ?L/min，注射完毕，停针5 min后，以1.0 mm/min速度缓慢拔针，缝合皮肤，术后肌肉注射青霉素，连续3 d，以防感染。
2.2 分组与治疗
实验分为正常组、模型组和电针组。对照大鼠穴位图谱，以13 mm毫针针灸“百会”（顶骨正中）、“肾俞”（第2腰椎下两旁），连接G6805A型电针治疗仪，选择连续波，频率为20 Hz。针刺治疗每日1次，每次30 min，1周为1个疗程，治疗4个疗程。正常组及模型组正常饲养，不予针刺治疗。在治疗结束后，各组分别在无菌条件下，下腔静脉采血，分离血清，过滤除菌，冰冻保存备用。
2.3 原代海马神经元的培养
出生24 h内SD大鼠，断头取脑，分离出双侧海马组织，消化，吹打后以1×106/mL的密度接种于培养板内。细胞培养7 d后，将其分为正常组、模型组和电针血清组，各组分别更换含有“2.2”项中各组10%血清的培养液，模型组和电针血清组予以 Aβ25-35（26 ?L/mL）处理48 h。
2.4 MTT法检测细胞增殖
用5 mL MTT溶剂溶解25 mg MTT，配制成5 mg/mL MTT溶液。设置调零孔，每孔加入10 ?L MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4 h，使其充分形成紫色结晶。每孔直接加入100 ?L Formanzan溶解液，在细胞培养箱内继续孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现 Formazan全部溶解。在570 nm波长测定吸光度（OD值）。
2.5 免疫组织化学染色
TUNEL染色：取出细胞培养板，免疫染色固定液固定细胞30 min，0.01 mol/L PBS洗涤1次，免疫染色洗涤液清洗1次， 0.01 mol/L PBS洗涤2次，在样品上加50 ?L TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗涤3次，抗荧光淬灭封片液封片后于荧光显微镜下观察并拍照。 Caspase-3免疫细胞化学染色：取出细胞培养板，免疫染色固定液固定细胞20 min，0.01 mol/L PBS洗涤3次，加入免疫染色封闭液，在37 ℃条件下孵育30 min，加入抗Caspase-3兔单克隆抗体，在4 ℃条件下孵育过夜，用PBS浸洗细胞3次，加入FITC-羊抗兔IgG，在37 ℃条件下孵育1 h，PBS洗涤3次，加入Hoechst 33342室温染色10 min，经PBS充分清洗后，缓冲甘油封片后荧光显微镜下观察并计数阳性细胞个数。
3 统计学方法
采用SPSS15.0统计软件进行分析。数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 海马神经元的培养与鉴定
接种后24 h，在倒置显微镜下可见全部细胞已贴壁，且伸出短小的突起。培养7 d后神经元胞体饱满，多呈梭形、锥形，少数呈多边形，细胞的突起进一步增多增长，大部分神经元有2～5个突起，形成神经元网络（见图1）。免疫细胞化学染色显示，培养7 d的大鼠海马神经元NSE和MAP-2抗体标记阳性（见图2）。NSE和MAP-2双标阳性细胞数达90%左右。
4.2 电针血清对神经元增殖的影响
MTT检测结果发现，与正常组比较，模型组细胞活力显著下降（P<0.01），而电针血清组与模型组比较，细胞增殖能力明显增强，差异有统计学意义（P<0.01）。见图3。
4.3 电针血清对神经元存活的影响
经Aβ处理48 h后，细胞发生明显凋亡，部分细胞从皿底脱落，甚至漂浮；与模型组比较，电针血清组凋亡细胞数明显减少（见图4）。通过计数200倍视野下TUNEL阳性细胞个数，经统计学分析发现，模型组和电针血清组凋亡细胞数目显著增多，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01），而电针血清组与模型组比较，凋亡细胞数目明显减少（P<0.01），见图5。
4.4 电针血清对Caspase-3表达的影响
在正常组，Caspase-3 表达水平很低，只有少数细胞表达Caspase-3。经Aβ处理48 h后，Caspase-3 表达水平明显升高，与正常组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。电针血清组也有部分细胞表达Caspase-3，但Caspase-3阳性细胞数目较模型组显著减少（P<0.01）。见表1。
5 讨论
AD在中医学中散见于“郁证”、“癫狂”、“呆病”、“健忘”等证的描述中，其发生和脑、脾、肾关系密切。针灸通过刺激人体特定的腧穴，激发经络之气，调整脏腑、经络及大脑的机能，促进衰退神经元的能量代谢，防治AD。本实验中，百会位于巅顶，通过督脉入络脑，乃局部取穴，以醒脑宁神；肾俞补肾养髓，髓海得充，可健脑益智，从而治疗老年痴呆。然而针灸治疗AD的具体作用机制目前尚未完全阐明。
AD的神经病理特征包括细胞外老年斑和细胞内神经原纤维缠结的产生，以及基底前脑支配海马和皮质的胆碱能神经元的丢失。目前普遍认为有神经毒性的Aβ聚集是AD发生和发展的始动因素[1]，所以AD 治疗主要集中在减少Aβ沉积和阻断具有毒性的Aβ的形成[6]。而海马与学习记忆功能密切相关，因此选用原代培养的海马神经元作为研究针刺治疗AD的作用机制较为理想。
Caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件，其激活与超常表达均引起细胞凋亡，可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡[7]。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，在凋亡的执行阶段，负责对全部或部分关键性蛋白的酶切[8]。我们前期实验表明，电针治疗可以降低大鼠海马区Caspase-3的表达，调控Bcl-2和Bax的表达平衡，维持神经元的存活[9]。而本研究发现，电针血清可以促进体外培养神经元的增殖，并可对抗Aβ诱导的凋亡。由此推测，电针治疗可能通过刺激动物血清成分的变化而发挥保护神经元并改善学习记忆的作用。
最近的研究表明，电针能有效调节帕金森病患者血清中脑源性神经营养因子的水平，从而缓解抑郁症状[8]。也有学者发现，电针肾俞、风府、足三里、三阴交可以提高脑组织和血清超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性，降低丙二醛含量，增强氧自由基清除能力从而发挥对神经元的保护作用[11]。在AD大鼠模型，电针治疗的过程中血清中成分发生什么样的变化，某种或某些神经营养因子的表达和分泌是否提高，值得进一步深入研究。
综上所述，电针血清可以有效降低AD大鼠海马神经元凋亡，而其机制可能是通过降低凋亡执行蛋白Caspase-3的表达，对抗Aβ的神经毒性，发挥对AD海马神经元的保护作用。
参考文献：
[1] Cavallucci V， D'Amelio M， Cecconi F. Aβ toxicity in Alzheimer's disease[J]. Mol Neurobiol，2012，45（2）：366-378.
[2] Cheng HY， Cheng DQ. Progress in research on acupuncture treatment of senile dementia[J]. J Tradit Chin Med，2009，29（3）：224-233.
[3] 蔡涛，肖冬玲.针刺对老年性痴呆患者Hcy、Aβ干预作用的临床观察[J].上海针灸杂志，2008，27（12）：3-5.
[4] 朱晶，国海东，邵水金.针灸治疗阿尔茨海默病机制的研究进展[J].针刺研究，2012，37（5）：422-427.
[5] 邵水金，单宝枝，张建华，等.电针血清对雪旺细胞的影响[J].上海针灸杂志，2000，9（增刊）：58-59.
[6] Barnham KJ， Kenche VB， Ciccotosto GD， et al. Platinum-based inhibitors of amyloid-beta as therapeutic agents for Alzheimer's disease [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（19）：6813-6818.
[7] Kumar S. Caspase function in programmed cell death[J]. Cell Death Differ，2007，14（1）：32-43.
[8] Fuchs Y， Steller H. Programmed cell death in animal development and disease[J]. Cell，2011，147（4）：742-758.
[9] 国海东，邵水金，朱晶，等.电针对阿尔茨海默病大鼠学习记忆力改善及海马神经元损伤保护的作用及机制[J].上海针灸杂志，2012，31（9）：682-685.
[10] 夏毅，王海东，丁莹，等.电针结合药物治疗帕金森伴发抑郁症及对患者血清BDNF的影响[J].中国针灸，2012，32（12）：1071-1074.
[11] 张晓琳，刘智艳，刘娟，等.电针对老年性痴呆大鼠记忆功能减退的影响[J].中华中医药杂志，2012，27（3）：706-708.
（收稿日期：2013-02-21，编辑：华强）