论文部分内容阅读
摘要：目的 观察电针对大鼠海马自噬相关蛋白Beclin-1和凋亡相关蛋白p53表达的影响，探讨电针治疗阿尔茨海默病（AD）的作用机制。方法 将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针组。电针组取“百会”和“涌泉”进行电针治疗，每日1次，7 d为1个疗程，共治疗4个疗程。疗程结束后尼氏染色观察各组海马CA1区组织形态的变化并计数尼氏体阳性细胞，Western blot检测Beclin-1和p53蛋白的表达。结果 模型组CA1区尼氏体阳性的细胞数目较正常组显著减少（P<0.01），电针组锥体细胞和尼氏体表达较模型组明显增多（P<0.05）。与正常组比较，模型组海马组织中Beclin-1蛋白表达降低、p53蛋白表达升高（P<0.05）；与模型组比较，电针组Beclin-1蛋白表达明显升高（P<0.01），p53蛋白表达降低（P<0.05）。结论 电针治疗可对抗β-淀粉样蛋白诱导的神经元凋亡，改善AD海马组织形态变化。
关键词：电针；阿尔茨海默病；凋亡；自噬；Beclin-1蛋白；p53蛋白；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.020
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）09-0068-04
基金项目：国家自然科学基金（81102670）；上海市高校青年教师专项基金（shzy015）；
上海中医药大学名师传承研究工程项目（2009120）
通讯作者：国海东，E-mail：[email protected]
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种慢性进行性的中枢神经系统退行性变性病，β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积形成的老年斑、神经原纤维缠结和神经元及其突触的缺失是其典型特征。目前AD的临床药物只能对症治疗，无法逆转其病理进程。自噬是细胞长寿命蛋白、变性或衰老细胞器的主要降解途径[1]。研究表明，自噬功能障碍与多种错折叠蛋白聚集体导致的神经变性疾病有关[2-3]。自噬障碍可能影响Aβ的清除和增加神经细胞死亡[4]，表明自噬可以保护神经元免受Aβ诱导的凋亡[5]，与AD的病理生理学密切相关。针灸治疗AD具有诸多的优势，且疗效明确[6-7]。本研究在构建AD大鼠模型的基础上，通过检测自噬相关蛋白Beclin-1和凋亡相关蛋白p53的表达变化，探讨电针治疗AD的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（200±50）g，上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（沪）2008-0016，实验室符合国家动物实验设施屏障系统标准。
1.2 主要试剂与仪器
Aβ1-40，美国Sigma公司；Beclin-1兔抗大鼠多克隆抗体和HRP标记山羊抗兔二抗，美国cell signaling technology公司；p53山羊抗大鼠多克隆抗体，美国Santa Cruz公司；HRP标记驴抗山羊二抗，美国Jackson ImmunoResearch公司；尼氏染色液和BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。针灸针，吴江市云龙医疗器械有限公司；立体定位仪（江湾I型），第二军医大学生理教研室研制；电泳仪和转膜仪，美国Bio-Rad公司。
2 实验方法
2.1 造模
将Aβ1-40溶于生理盐水，再用PBS稀释成终浓度5 μg/μL，37 ℃孵育1周，使其变为聚集状态[8]。腹腔注射10%水合氯醛麻醉SD大鼠，将其头部固定于脑立体定位仪上，剪毛后常规皮肤消毒，沿正中矢状线纵行切开皮肤，暴露前囟，参考大鼠脑立体定位图谱[9]，以前囟为原点，向后3.5 mm，左、右旁开2.0 mm为注射点，用牙科钻钻开左右对称的2个小孔，自脑颅骨表面进针深度为3.0 mm，用微量进样器抽取2 μL Aβ1-40，每点缓慢注射1 μL，5 min内注射完毕，注射完毕后留针5 min，使Aβ1-40扩散至注射部位，缓慢拔针后缝合皮肤。为防止感染，术后连续3 d肌肉注射青霉素8万单位。假手术组注射等量人工脑脊液。
2.2 分组与治疗
模型建立后7 d开始进行电针治疗。大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针组，每组6只。电针组取“百会”和“涌泉”，用0.25 mm×13 mm无菌毫针，“百会”平刺约2.5 mm，“涌泉”直刺约1.5 mm，连接G6805A型电针治疗仪，选择连续波，频率为20 Hz，强度以肢体局部轻微抖动且大鼠能安静耐受为度。针刺治疗每日1次，每次30 min，7 d为1个疗程，疗程间休息1 d，治疗4个疗程。正常组、假手术组及模型组正常饲养，不予电针治疗。
2.3 尼氏染色
Morris水迷宫检测结束后，部分动物经10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，打开胸腔，充分暴露心脏，将注射针头插入左心室，随即剪开右心耳，快速灌注100 mL预冷的0.9%氯化钠溶液将血管内血液冲洗干净，然后缓慢灌注250 mL预冷的4%多聚甲醛至大鼠四肢强直、全身变硬后，快速断头取脑。将脑组织置于4%多聚甲醛中后固定24 h，然后进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋。以注射点为中心做5 μm厚冠状切片，所有切片均包含海马区。取各组切片，二甲苯脱蜡、水化后，滴加尼氏染色液，室温染色10 min，分别经脱水、透明后用中性树胶封片，显微镜下观察各组海马CA1区尼氏体的表达。每只动物随即选取5个视野进行细胞计数。
2.4 Beclin-1和p53蛋白表达测定
采用Western blot方法测定。各组大鼠颈椎脱臼处死取脑，冰上分离海马组织，加入含苯甲酰磺酰氟的RIPA裂解液，玻璃匀浆器冰上匀浆后离心，收集总蛋白，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各标本蛋白浓度。每个标本各取30 μg上样后进行SDS-PAGE凝胶电泳。在半干转印仪上转膜40 min将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h。倾去封闭液后，分别与Beclin-1、p53、GAPDH一抗和HRP标记二抗孵育。磷酸盐吐温缓冲液洗膜3次后，滴加增强化学发光化学发光试剂反应1 min，将膜固定于片夹内，暗室压片，显影定影。扫描胶片后，通过ImageJ图像分析软件计算目的蛋白的表达量，用目的蛋白的净像素值与GAPDH的净像素值的比值表示。 3 统计学方法
采用SPSS15.0统计软件进行分析。实验数据均用—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 电针对大鼠海马CA1区形态学的影响
尼氏染色观察可见，正常组和假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞层次丰富，排列紧密整齐，尼氏体染色较深；与正常组比较，模型组海马CA1区锥体细胞排列稀疏杂乱，细胞缺失，尼氏体表达明显减弱，甚至消失；电针治疗后，海马组织形态明显好转，锥体细胞和尼氏体表达显著增多，但仍未达到正常组和假手术组的水平。与正常组比较，模型组CA1区尼氏体阳性的细胞数目明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，电针组CA1区尼氏体阳性的细胞数目明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）。
）
4.2 电针对大鼠海马组织Beclin-1、p53蛋白表达的影响
图1 各组大鼠海马组织Beclin-1和p53蛋白表达
5 讨论
AD是引起老年痴呆最常见的原因。这种神经退行性疾病典型地以渐进性记忆衰减开始，并且最终不可逆地发展为全面认知功能障碍。海马是人类大脑处理学习和记忆的关键区域。神经元有规则的排列是海马和齿状回皮层构造最突出的特征。海马的主神经元包括锥体细胞和颗粒细胞，它们密集排布呈显著的带状，构成海马非常明显的界限。不同的形态结构是器官组织执行各种生理功能的物质基础。随着AD病理进程的发展，海马神经元逐渐丧失，从而引起记忆和认知功能衰退的临床症状[10]。本研究显示，正常组大鼠海马CA1区锥体细胞排列紧密整齐，尼氏体染色较深，模型组海马CA1区锥体细胞排列稀疏杂乱，大量神经元缺失，尼氏体表达明显减弱，甚至消失。电针治疗可明显改善海马组织形态结构。与模型组比较，电针组CA1区尼氏体阳性细胞的数目较模型组显著增多。结果提示，电针可保护海马区神经元抵抗Aβ造成的细胞丢失，从而保持海马区正常的神经元排布特征，改善和提高学习记忆和认知功能。
研究表明，AD等神经退行性疾病与自噬功能障碍密切相关。自噬可通过降解长寿命蛋白、蛋白聚合物以及损伤细胞器调控细胞的稳态。自噬的过程包括一系列有序的步骤，包括核化、延长、包裹、降解等程序，其降解产物氨基酸可被机体重新利用。Beclin-1是自噬相关的特异性基因，直接参与自噬体的形成，在自噬体形成的核化阶段发挥调控作用[11]。在转基因小鼠AD模型中，Beclin-1杂合缺失降低神经细胞的自噬，可以增加9月龄小鼠神经细胞内Aβ的积聚和沉积，并促进神经变性[2]。自噬调节或Aβ-α7nAChR运输系统的障碍可能影响Aβ的清除和增加神经细胞死亡[4]。本研究表明，Aβ注射可使海马组织Beclin-1表达减少，而电针能提高Beclin-1水平，通过调控自噬活性，减少神经元丢失，改善受损组织形态结构。
p53为肿瘤抑制基因，编码一种分子量为53 kDa的蛋白质p53，在控制细胞周期、细胞凋亡、基因组稳定性、抑制血管新生等方面扮演重要角色。p53调控凋亡的作用已受到广泛重视。p53主要通过线粒体途径介导细胞的凋亡。它通过转录活化多种靶基因，如p21、Bax、Bcl-2等调节细胞周期或细胞凋亡。p53表达水平在AD动物模型和AD患者脑中明显升高[12]，这与海马神经元的凋亡有直接的关系。本研究发现，电针治疗可明显降低海马组织p53的表达水平。这与以前的报道结果一致[13]。我们发现，电针可以调节Bax和Bcl-2的平衡比值和凋亡执行蛋白Caspase-3的表达，对抗Aβ诱导的神经元凋亡[7]。本研究进一步提出，电针可能通过调控p53途径，介导其下游蛋白Bax、Bcl-2等的表达，发挥抗凋亡作用。
虽然凋亡和自噬在形态学和生化代谢途径方面都有显著的区别，但二者在功能上却存在一定的联系。自噬是一把双刃剑，一般来说，自噬通常先于凋亡，在病理环境早期，自噬可保护细胞免于发生凋亡，而随着过度自噬的发生，自噬又可向凋亡转化，最终导致细胞死亡。在Aβ毒性下，出现大量自噬体的神经元并未见凋亡现象，通过3-甲基腺嘌呤抑制自噬可能导致神经元凋亡。这些结果表明自噬可以保护神经元免受Aβ诱导的凋亡[5]。p53不仅与细胞凋亡有关，而且还参与了自噬的调控[14]。Beclin-1可影响泛素特异性肽酶USP10和USP13的去泛素化活性，从而对p53蛋白水平进行调控[15]。本研究结果也提示，电针可能通过上调自噬活性，减少p53介导的神经元凋亡。
综上所述，电针治疗可通过上调海马组织中自噬相关蛋白Beclin-1的水平，介导促凋亡相关蛋白p53的表达，对抗Aβ诱导的神经元凋亡，减少神经元的丢失，改善海马组织的形态变化。本研究为推广电针治疗AD及阐明电针治疗AD作用机制提供了实验依据。
参考文献：
[1] Mizushima N， Levine B， Cuervo AM， et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J]. Nature，2008，451（7182）：1069- 1075.
[2] Pickford F， Masliah E， Britschgi M， et al. The autophagy-related protein Bclin 1 shows reduced expression in early Alzheimer disease and regulates amyloid β accumulation in mice[J]. J Clin Invest，2008，118（6）：2190-2199.
[3] Tan CC， Yu JT， Tan MS， et al. Autophagy in aging and neurodegenerative diseases：implications for pathogenesis and therapy[J]. Neurobiol Aging，2014，35（5）：941-957. [4] Hung SY， Huang WP， Liou HC， et al. Autophagy protects neuron from Aβ-induced cytotoxicity[J]. Autophagy，2009，5（4）：502-510.
[5] Cheung YT， Zhang NQ， Hung CH， et al. Temporal relationship of autophagy and apoptosis in neurons challenged by low molecular weight β-amyloid peptide[J]. J Cell Mol Med，2011，15（2）：244-257.
[6] 代渊，王飞，徐世军.中医治疗阿尔茨海默病优势述略[J].中国中医药信息杂志，2010，17（8）：5-6.
[7] 国海东，邵水金，朱晶，等.电针对阿尔茨海默病大鼠学习记忆力改善及海马神经元损伤保护的作用及机制[J].上海针灸杂志，2012，31（9）：682-685.
[8] Frautschy SA， Yang F， Calderón L， et al. Rodent models of Alzheimer's disease： rat A beta infusion approaches to amyloid deposits[J]. Neurobiol Aging，1996，17（2）：311-321.
[9] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003：241-248.
[10] Jovanovi? Z. Mechanisms of neurodegeneration in Alzheimer's disease[J]. Med Pregl，2012，65（7/8）：301-307.
[11] 国海东，国海光，邵水金.自噬在阿尔茨海默病中的作用及其机制[J].生理科学进展，2011，42（5）：398-401.
[12] Dorszewska J， Oczkowska A， Suwalska M， et al. Mutations in the exon 7 of Trp53 gene and the level of p53 protein in double transgenic mouse model of Alzheimer's disease[J]. Folia Neuropathol，2014，52（1）：30-40.
[13] 刘金凤，张莹，孙金平，等.针刺疗法对老年痴呆小鼠脑内p53蛋白表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2013，33（10）：1367-1371.
[14] Sebti S， Prébois C， Pérez-Gracia E， et al. BAT3 modulates p300-dependent acetylation of p53 and autophagy-related protein 7 （ATG7） during autophagy[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2014， 111（11）：4115-4120.
[15] Liu J， Xia H， Kim M， et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13[J]. Cell，2011，147（1）：223-234.
（收稿日期：2014-03-12；编辑：华强）
关键词：电针；阿尔茨海默病；凋亡；自噬；Beclin-1蛋白；p53蛋白；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.020
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）09-0068-04
基金项目：国家自然科学基金（81102670）；上海市高校青年教师专项基金（shzy015）；
上海中医药大学名师传承研究工程项目（2009120）
通讯作者：国海东，E-mail：[email protected]
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种慢性进行性的中枢神经系统退行性变性病，β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积形成的老年斑、神经原纤维缠结和神经元及其突触的缺失是其典型特征。目前AD的临床药物只能对症治疗，无法逆转其病理进程。自噬是细胞长寿命蛋白、变性或衰老细胞器的主要降解途径[1]。研究表明，自噬功能障碍与多种错折叠蛋白聚集体导致的神经变性疾病有关[2-3]。自噬障碍可能影响Aβ的清除和增加神经细胞死亡[4]，表明自噬可以保护神经元免受Aβ诱导的凋亡[5]，与AD的病理生理学密切相关。针灸治疗AD具有诸多的优势，且疗效明确[6-7]。本研究在构建AD大鼠模型的基础上，通过检测自噬相关蛋白Beclin-1和凋亡相关蛋白p53的表达变化，探讨电针治疗AD的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（200±50）g，上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（沪）2008-0016，实验室符合国家动物实验设施屏障系统标准。
1.2 主要试剂与仪器
Aβ1-40，美国Sigma公司；Beclin-1兔抗大鼠多克隆抗体和HRP标记山羊抗兔二抗，美国cell signaling technology公司；p53山羊抗大鼠多克隆抗体，美国Santa Cruz公司；HRP标记驴抗山羊二抗，美国Jackson ImmunoResearch公司；尼氏染色液和BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。针灸针，吴江市云龙医疗器械有限公司；立体定位仪（江湾I型），第二军医大学生理教研室研制；电泳仪和转膜仪，美国Bio-Rad公司。
2 实验方法
2.1 造模
将Aβ1-40溶于生理盐水，再用PBS稀释成终浓度5 μg/μL，37 ℃孵育1周，使其变为聚集状态[8]。腹腔注射10%水合氯醛麻醉SD大鼠，将其头部固定于脑立体定位仪上，剪毛后常规皮肤消毒，沿正中矢状线纵行切开皮肤，暴露前囟，参考大鼠脑立体定位图谱[9]，以前囟为原点，向后3.5 mm，左、右旁开2.0 mm为注射点，用牙科钻钻开左右对称的2个小孔，自脑颅骨表面进针深度为3.0 mm，用微量进样器抽取2 μL Aβ1-40，每点缓慢注射1 μL，5 min内注射完毕，注射完毕后留针5 min，使Aβ1-40扩散至注射部位，缓慢拔针后缝合皮肤。为防止感染，术后连续3 d肌肉注射青霉素8万单位。假手术组注射等量人工脑脊液。
2.2 分组与治疗
模型建立后7 d开始进行电针治疗。大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针组，每组6只。电针组取“百会”和“涌泉”，用0.25 mm×13 mm无菌毫针，“百会”平刺约2.5 mm，“涌泉”直刺约1.5 mm，连接G6805A型电针治疗仪，选择连续波，频率为20 Hz，强度以肢体局部轻微抖动且大鼠能安静耐受为度。针刺治疗每日1次，每次30 min，7 d为1个疗程，疗程间休息1 d，治疗4个疗程。正常组、假手术组及模型组正常饲养，不予电针治疗。
2.3 尼氏染色
Morris水迷宫检测结束后，部分动物经10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，打开胸腔，充分暴露心脏，将注射针头插入左心室，随即剪开右心耳，快速灌注100 mL预冷的0.9%氯化钠溶液将血管内血液冲洗干净，然后缓慢灌注250 mL预冷的4%多聚甲醛至大鼠四肢强直、全身变硬后，快速断头取脑。将脑组织置于4%多聚甲醛中后固定24 h，然后进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋。以注射点为中心做5 μm厚冠状切片，所有切片均包含海马区。取各组切片，二甲苯脱蜡、水化后，滴加尼氏染色液，室温染色10 min，分别经脱水、透明后用中性树胶封片，显微镜下观察各组海马CA1区尼氏体的表达。每只动物随即选取5个视野进行细胞计数。
2.4 Beclin-1和p53蛋白表达测定
采用Western blot方法测定。各组大鼠颈椎脱臼处死取脑，冰上分离海马组织，加入含苯甲酰磺酰氟的RIPA裂解液，玻璃匀浆器冰上匀浆后离心，收集总蛋白，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各标本蛋白浓度。每个标本各取30 μg上样后进行SDS-PAGE凝胶电泳。在半干转印仪上转膜40 min将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h。倾去封闭液后，分别与Beclin-1、p53、GAPDH一抗和HRP标记二抗孵育。磷酸盐吐温缓冲液洗膜3次后，滴加增强化学发光化学发光试剂反应1 min，将膜固定于片夹内，暗室压片，显影定影。扫描胶片后，通过ImageJ图像分析软件计算目的蛋白的表达量，用目的蛋白的净像素值与GAPDH的净像素值的比值表示。 3 统计学方法
采用SPSS15.0统计软件进行分析。实验数据均用—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 电针对大鼠海马CA1区形态学的影响
尼氏染色观察可见，正常组和假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞层次丰富，排列紧密整齐，尼氏体染色较深；与正常组比较，模型组海马CA1区锥体细胞排列稀疏杂乱，细胞缺失，尼氏体表达明显减弱，甚至消失；电针治疗后，海马组织形态明显好转，锥体细胞和尼氏体表达显著增多，但仍未达到正常组和假手术组的水平。与正常组比较，模型组CA1区尼氏体阳性的细胞数目明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，电针组CA1区尼氏体阳性的细胞数目明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）。
）
4.2 电针对大鼠海马组织Beclin-1、p53蛋白表达的影响
图1 各组大鼠海马组织Beclin-1和p53蛋白表达
5 讨论
AD是引起老年痴呆最常见的原因。这种神经退行性疾病典型地以渐进性记忆衰减开始，并且最终不可逆地发展为全面认知功能障碍。海马是人类大脑处理学习和记忆的关键区域。神经元有规则的排列是海马和齿状回皮层构造最突出的特征。海马的主神经元包括锥体细胞和颗粒细胞，它们密集排布呈显著的带状，构成海马非常明显的界限。不同的形态结构是器官组织执行各种生理功能的物质基础。随着AD病理进程的发展，海马神经元逐渐丧失，从而引起记忆和认知功能衰退的临床症状[10]。本研究显示，正常组大鼠海马CA1区锥体细胞排列紧密整齐，尼氏体染色较深，模型组海马CA1区锥体细胞排列稀疏杂乱，大量神经元缺失，尼氏体表达明显减弱，甚至消失。电针治疗可明显改善海马组织形态结构。与模型组比较，电针组CA1区尼氏体阳性细胞的数目较模型组显著增多。结果提示，电针可保护海马区神经元抵抗Aβ造成的细胞丢失，从而保持海马区正常的神经元排布特征，改善和提高学习记忆和认知功能。
研究表明，AD等神经退行性疾病与自噬功能障碍密切相关。自噬可通过降解长寿命蛋白、蛋白聚合物以及损伤细胞器调控细胞的稳态。自噬的过程包括一系列有序的步骤，包括核化、延长、包裹、降解等程序，其降解产物氨基酸可被机体重新利用。Beclin-1是自噬相关的特异性基因，直接参与自噬体的形成，在自噬体形成的核化阶段发挥调控作用[11]。在转基因小鼠AD模型中，Beclin-1杂合缺失降低神经细胞的自噬，可以增加9月龄小鼠神经细胞内Aβ的积聚和沉积，并促进神经变性[2]。自噬调节或Aβ-α7nAChR运输系统的障碍可能影响Aβ的清除和增加神经细胞死亡[4]。本研究表明，Aβ注射可使海马组织Beclin-1表达减少，而电针能提高Beclin-1水平，通过调控自噬活性，减少神经元丢失，改善受损组织形态结构。
p53为肿瘤抑制基因，编码一种分子量为53 kDa的蛋白质p53，在控制细胞周期、细胞凋亡、基因组稳定性、抑制血管新生等方面扮演重要角色。p53调控凋亡的作用已受到广泛重视。p53主要通过线粒体途径介导细胞的凋亡。它通过转录活化多种靶基因，如p21、Bax、Bcl-2等调节细胞周期或细胞凋亡。p53表达水平在AD动物模型和AD患者脑中明显升高[12]，这与海马神经元的凋亡有直接的关系。本研究发现，电针治疗可明显降低海马组织p53的表达水平。这与以前的报道结果一致[13]。我们发现，电针可以调节Bax和Bcl-2的平衡比值和凋亡执行蛋白Caspase-3的表达，对抗Aβ诱导的神经元凋亡[7]。本研究进一步提出，电针可能通过调控p53途径，介导其下游蛋白Bax、Bcl-2等的表达，发挥抗凋亡作用。
虽然凋亡和自噬在形态学和生化代谢途径方面都有显著的区别，但二者在功能上却存在一定的联系。自噬是一把双刃剑，一般来说，自噬通常先于凋亡，在病理环境早期，自噬可保护细胞免于发生凋亡，而随着过度自噬的发生，自噬又可向凋亡转化，最终导致细胞死亡。在Aβ毒性下，出现大量自噬体的神经元并未见凋亡现象，通过3-甲基腺嘌呤抑制自噬可能导致神经元凋亡。这些结果表明自噬可以保护神经元免受Aβ诱导的凋亡[5]。p53不仅与细胞凋亡有关，而且还参与了自噬的调控[14]。Beclin-1可影响泛素特异性肽酶USP10和USP13的去泛素化活性，从而对p53蛋白水平进行调控[15]。本研究结果也提示，电针可能通过上调自噬活性，减少p53介导的神经元凋亡。
综上所述，电针治疗可通过上调海马组织中自噬相关蛋白Beclin-1的水平，介导促凋亡相关蛋白p53的表达，对抗Aβ诱导的神经元凋亡，减少神经元的丢失，改善海马组织的形态变化。本研究为推广电针治疗AD及阐明电针治疗AD作用机制提供了实验依据。
参考文献：
[1] Mizushima N， Levine B， Cuervo AM， et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J]. Nature，2008，451（7182）：1069- 1075.
[2] Pickford F， Masliah E， Britschgi M， et al. The autophagy-related protein Bclin 1 shows reduced expression in early Alzheimer disease and regulates amyloid β accumulation in mice[J]. J Clin Invest，2008，118（6）：2190-2199.
[3] Tan CC， Yu JT， Tan MS， et al. Autophagy in aging and neurodegenerative diseases：implications for pathogenesis and therapy[J]. Neurobiol Aging，2014，35（5）：941-957. [4] Hung SY， Huang WP， Liou HC， et al. Autophagy protects neuron from Aβ-induced cytotoxicity[J]. Autophagy，2009，5（4）：502-510.
[5] Cheung YT， Zhang NQ， Hung CH， et al. Temporal relationship of autophagy and apoptosis in neurons challenged by low molecular weight β-amyloid peptide[J]. J Cell Mol Med，2011，15（2）：244-257.
[6] 代渊，王飞，徐世军.中医治疗阿尔茨海默病优势述略[J].中国中医药信息杂志，2010，17（8）：5-6.
[7] 国海东，邵水金，朱晶，等.电针对阿尔茨海默病大鼠学习记忆力改善及海马神经元损伤保护的作用及机制[J].上海针灸杂志，2012，31（9）：682-685.
[8] Frautschy SA， Yang F， Calderón L， et al. Rodent models of Alzheimer's disease： rat A beta infusion approaches to amyloid deposits[J]. Neurobiol Aging，1996，17（2）：311-321.
[9] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003：241-248.
[10] Jovanovi? Z. Mechanisms of neurodegeneration in Alzheimer's disease[J]. Med Pregl，2012，65（7/8）：301-307.
[11] 国海东，国海光，邵水金.自噬在阿尔茨海默病中的作用及其机制[J].生理科学进展，2011，42（5）：398-401.
[12] Dorszewska J， Oczkowska A， Suwalska M， et al. Mutations in the exon 7 of Trp53 gene and the level of p53 protein in double transgenic mouse model of Alzheimer's disease[J]. Folia Neuropathol，2014，52（1）：30-40.
[13] 刘金凤，张莹，孙金平，等.针刺疗法对老年痴呆小鼠脑内p53蛋白表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2013，33（10）：1367-1371.
[14] Sebti S， Prébois C， Pérez-Gracia E， et al. BAT3 modulates p300-dependent acetylation of p53 and autophagy-related protein 7 （ATG7） during autophagy[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2014， 111（11）：4115-4120.
[15] Liu J， Xia H， Kim M， et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13[J]. Cell，2011，147（1）：223-234.
（收稿日期：2014-03-12；编辑：华强）