论文部分内容阅读
【中图分类号】R284.1【文献标识码】A【文章编号】1632-5281（2016）2
[摘要] [目的] ]探讨用硫酸-苯酚法测定白术多糖含量与用硫酸-蒽酮法测定白术多糖含量结果的差异。 [方法] 利用紫外-可见分光光度计，分别采用硫酸-蒽酮法和苯酚-硫酸法测定白术多糖的含量。[结果] 白术多糖含量硫酸-蒽酮法测的结果高于硫酸-苯酚法，数据差异显著，具有统计学意义。[结论]就白术多糖含量的测量而言，硫酸-蒽酮法比硫酸-苯酚法更适合。
[关键词] 白术多糖；蒽酮-硫酸法；苯酚-硫酸法；含量测定
中图分类号：R284.1
目前白术多糖的含量测定采用硫酸-苯酚法或硫酸-蒽酮法测定的多见报道，但未见报道两种方法测定结果准确性的比较。本实验采用两种方法测定白术多糖含量，比较两种方法测量白术多糖含量的差异，寻找最佳测定方案，以便于进一步的药理研究。
1 仪器与药品
1.1 仪器 莱伯泰科有限公司（北京）UV-9100-B紫外光-可见光分光光度计；精密仪器有限公司（上海）FA1004N 型电子分析天平；超声仪器有限公司（昆山市）KQ-500E 型超声波清洗器；恒一科学仪器有限公司（上海）DZF-6050型真空干燥箱；医用离心机厂（北京）LDZ4-0.8型离心机；GILSON公司（法国）微量移液器；医疗设备厂（北京）HWLC型电热恒温水水温箱；医疗设备厂（北京）SH-III型循环水式多用真空泵。
1.2 药品 白术饮片（购于山东博康中药饮片公司）；蒽酮，苯酚（重蒸），浓硫酸（AR），氢氧化钠（AR），硫酸锌（AR），氯化钡（AR），正丁醇（AR），氯仿（AR），丙酮（AR），葡萄糖（AR）；95%乙醇。
2 方法与结果
2.1 白术多糖的提取
精密称取1.00g白术颗粒，置于250mL锥形瓶中，加入100mL蒸馏水，50℃超声提取1h， 加10%ZnSO42mL和饱和Ba（OH）2溶液1mL沉淀蛋白，振摇后静置，上清液加几滴Ba（OH）2溶液直至沉淀产生完全，过滤，滤液静置过夜，然后除去沉淀，加入4倍体积的95%乙醇， 4℃沉降过夜，滤液经离心后收集沉淀，沉淀用乙醇、丙酮各洗涤两次后，于真空干燥箱中40℃真空干燥至恒重，即得白术粗多糖[1]。
2.2 葡萄糖标准溶液及对照品溶液的制备
2.2.1 样品溶液的制备：把所得的所有白术粗多糖溶于水中，定容至10mL，得白术粗多糖溶液。精密量取2.00mL粗多糖溶液，加入2.00mL的Sevage试剂（正丁醇：三氯甲烷=1：4），摇匀，搅拌，离心，取水层，再加入等体积的Sevage液，重复操作，直至氯仿与水的分界面无沉淀，离心，取上清液，即为样品溶液。
2.2.2对照品溶液的制备：以无水葡萄糖作为对照品，精密称量10mg对照品溶解，定容至100mL，摇匀，即得0.10mg/mL葡萄糖溶液。
2.3白术多糖含量采用硫酸-蒽酮法测定
2.3.1 蒽酮试液的制备：称取0.20g蒽酮，加入100mL硫酸，用玻璃棒搅拌至完全溶解即得蒽酮试液（当日配置使用）。
2.3.2 标准曲线的制备：分别精密量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL对照品溶液，置于25mL具塞试管中，加蒸馏水补至2.00mL，对照组加入2.00mL蒸馏水作空白对照。各管分别加入蒽酮试液8.00mL，迅速摇匀后冰水冷却至室温，然后沸水浴加热10分钟后取出，置于冰水中冷却后，室温放置10分钟，取出，于622.5nm波长处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归计算，得回归方程y=7.089x+0.0171，r=0.9982，线性范围为0～0.10mg/mL，绘制标准曲线如图1。
图1标准曲线（硫酸-苯酚法测）
2.3.3 多糖含量的测定：每组精密量取9组白术多糖溶液各50μL，分别置于25mL具塞试管中，各管加蒸馏水补至2.00mL，按照“2.3.2”项下方法，测定吸光度，根据标准曲线回归方程计算得出白术多糖含量，结果见表1。
2.4白术多糖含量采用硫酸-苯酚法测定
2.4.1 苯酚溶液的制备：精密称取2.50g苯酚，加适量蒸馏水溶解后，定容至50mL，摇匀，得5%的苯酚溶液（现配现用）。
2.4.2 标准曲线的制备：分别精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL对照品溶液，置于5支25mL具塞试管中，各管加蒸馏水补至2.00mL，对照组加入2.00mL蒸馏水作空白对照。各管精密加入1.00mL苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0mL浓硫酸，摇匀，静置10分钟后，于40℃中水浴15分钟，将试管取出冷却至室温，于490nm波长处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归，得回归方程y=1.3223x-0.0295，r=0.9954，线性范围为0～0.05mg/mL，绘制标准曲线如图2。
图2标准曲线（硫酸-苯酚法测）
2.4.3 多糖含量的测定：精密量取9组多糖溶液各50μL，置于25mL具塞试管中，各管分别加蒸馏水补至2.00mL，按照“2.4.2”项下方法，测定吸光度，根据标准曲线回归方程计算得出白术多糖含量，结果见表1。
2.5 结果
采用两种方法测定白术多糖含量结果如下：
对表1中的数据进行F检验（方差齐性检验），F=3.0660，在置信度为95%下查表知，F<3.44，可认为硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法测定白术多糖含量的结果数据精密度不存在显著性差异。
t检验：t=3.9799，在置信度为95%下查表知，t<2.09，可认为两种方法测得的多糖含量存在显著性差异，白术多糖含量的测定结果硫酸-蒽酮法高于硫酸-苯酚法。
3 讨论
硫酸-苯酚法中苯酚易氧化，要用重蒸苯酚，对实验技能要求较高，且水浴温度要求为40℃，实验过程中要时刻注意温度。相比较而言，硫酸-蒽酮法的沸水浴条件更易控制，操作更为简便，适合于初学者使用。
总体而言，硫酸-蒽酮法操作更为简便，测定白术多糖含量得出的结果更为合理准确，因此更适合于白术多糖含量的测定。
参考文献
[1] 马艳.白术多糖提取工艺研究[J].中药材，2006（10）：107-109.
[2] 国家药典委员会，中华人民共和国药典2005年版一部[S].北京：化学工业出版社：2005：174
[3] 张杰，李春燕，李劲平，潘娟，向大雄.蒽酮硫酸法与苯酚硫酸法测定竹节参多糖后含量的比较研究[J].中南药学.2012（6）：421-424.
[摘要] [目的] ]探讨用硫酸-苯酚法测定白术多糖含量与用硫酸-蒽酮法测定白术多糖含量结果的差异。 [方法] 利用紫外-可见分光光度计，分别采用硫酸-蒽酮法和苯酚-硫酸法测定白术多糖的含量。[结果] 白术多糖含量硫酸-蒽酮法测的结果高于硫酸-苯酚法，数据差异显著，具有统计学意义。[结论]就白术多糖含量的测量而言，硫酸-蒽酮法比硫酸-苯酚法更适合。
[关键词] 白术多糖；蒽酮-硫酸法；苯酚-硫酸法；含量测定
中图分类号：R284.1
目前白术多糖的含量测定采用硫酸-苯酚法或硫酸-蒽酮法测定的多见报道，但未见报道两种方法测定结果准确性的比较。本实验采用两种方法测定白术多糖含量，比较两种方法测量白术多糖含量的差异，寻找最佳测定方案，以便于进一步的药理研究。
1 仪器与药品
1.1 仪器 莱伯泰科有限公司（北京）UV-9100-B紫外光-可见光分光光度计；精密仪器有限公司（上海）FA1004N 型电子分析天平；超声仪器有限公司（昆山市）KQ-500E 型超声波清洗器；恒一科学仪器有限公司（上海）DZF-6050型真空干燥箱；医用离心机厂（北京）LDZ4-0.8型离心机；GILSON公司（法国）微量移液器；医疗设备厂（北京）HWLC型电热恒温水水温箱；医疗设备厂（北京）SH-III型循环水式多用真空泵。
1.2 药品 白术饮片（购于山东博康中药饮片公司）；蒽酮，苯酚（重蒸），浓硫酸（AR），氢氧化钠（AR），硫酸锌（AR），氯化钡（AR），正丁醇（AR），氯仿（AR），丙酮（AR），葡萄糖（AR）；95%乙醇。
2 方法与结果
2.1 白术多糖的提取
精密称取1.00g白术颗粒，置于250mL锥形瓶中，加入100mL蒸馏水，50℃超声提取1h， 加10%ZnSO42mL和饱和Ba（OH）2溶液1mL沉淀蛋白，振摇后静置，上清液加几滴Ba（OH）2溶液直至沉淀产生完全，过滤，滤液静置过夜，然后除去沉淀，加入4倍体积的95%乙醇， 4℃沉降过夜，滤液经离心后收集沉淀，沉淀用乙醇、丙酮各洗涤两次后，于真空干燥箱中40℃真空干燥至恒重，即得白术粗多糖[1]。
2.2 葡萄糖标准溶液及对照品溶液的制备
2.2.1 样品溶液的制备：把所得的所有白术粗多糖溶于水中，定容至10mL，得白术粗多糖溶液。精密量取2.00mL粗多糖溶液，加入2.00mL的Sevage试剂（正丁醇：三氯甲烷=1：4），摇匀，搅拌，离心，取水层，再加入等体积的Sevage液，重复操作，直至氯仿与水的分界面无沉淀，离心，取上清液，即为样品溶液。
2.2.2对照品溶液的制备：以无水葡萄糖作为对照品，精密称量10mg对照品溶解，定容至100mL，摇匀，即得0.10mg/mL葡萄糖溶液。
2.3白术多糖含量采用硫酸-蒽酮法测定
2.3.1 蒽酮试液的制备：称取0.20g蒽酮，加入100mL硫酸，用玻璃棒搅拌至完全溶解即得蒽酮试液（当日配置使用）。
2.3.2 标准曲线的制备：分别精密量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL对照品溶液，置于25mL具塞试管中，加蒸馏水补至2.00mL，对照组加入2.00mL蒸馏水作空白对照。各管分别加入蒽酮试液8.00mL，迅速摇匀后冰水冷却至室温，然后沸水浴加热10分钟后取出，置于冰水中冷却后，室温放置10分钟，取出，于622.5nm波长处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归计算，得回归方程y=7.089x+0.0171，r=0.9982，线性范围为0～0.10mg/mL，绘制标准曲线如图1。
图1标准曲线（硫酸-苯酚法测）
2.3.3 多糖含量的测定：每组精密量取9组白术多糖溶液各50μL，分别置于25mL具塞试管中，各管加蒸馏水补至2.00mL，按照“2.3.2”项下方法，测定吸光度，根据标准曲线回归方程计算得出白术多糖含量，结果见表1。
2.4白术多糖含量采用硫酸-苯酚法测定
2.4.1 苯酚溶液的制备：精密称取2.50g苯酚，加适量蒸馏水溶解后，定容至50mL，摇匀，得5%的苯酚溶液（现配现用）。
2.4.2 标准曲线的制备：分别精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL对照品溶液，置于5支25mL具塞试管中，各管加蒸馏水补至2.00mL，对照组加入2.00mL蒸馏水作空白对照。各管精密加入1.00mL苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0mL浓硫酸，摇匀，静置10分钟后，于40℃中水浴15分钟，将试管取出冷却至室温，于490nm波长处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归，得回归方程y=1.3223x-0.0295，r=0.9954，线性范围为0～0.05mg/mL，绘制标准曲线如图2。
图2标准曲线（硫酸-苯酚法测）
2.4.3 多糖含量的测定：精密量取9组多糖溶液各50μL，置于25mL具塞试管中，各管分别加蒸馏水补至2.00mL，按照“2.4.2”项下方法，测定吸光度，根据标准曲线回归方程计算得出白术多糖含量，结果见表1。
2.5 结果
采用两种方法测定白术多糖含量结果如下：
对表1中的数据进行F检验（方差齐性检验），F=3.0660，在置信度为95%下查表知，F<3.44，可认为硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法测定白术多糖含量的结果数据精密度不存在显著性差异。
t检验：t=3.9799，在置信度为95%下查表知，t<2.09，可认为两种方法测得的多糖含量存在显著性差异，白术多糖含量的测定结果硫酸-蒽酮法高于硫酸-苯酚法。
3 讨论
硫酸-苯酚法中苯酚易氧化，要用重蒸苯酚，对实验技能要求较高，且水浴温度要求为40℃，实验过程中要时刻注意温度。相比较而言，硫酸-蒽酮法的沸水浴条件更易控制，操作更为简便，适合于初学者使用。
总体而言，硫酸-蒽酮法操作更为简便，测定白术多糖含量得出的结果更为合理准确，因此更适合于白术多糖含量的测定。
参考文献
[1] 马艳.白术多糖提取工艺研究[J].中药材，2006（10）：107-109.
[2] 国家药典委员会，中华人民共和国药典2005年版一部[S].北京：化学工业出版社：2005：174
[3] 张杰，李春燕，李劲平，潘娟，向大雄.蒽酮硫酸法与苯酚硫酸法测定竹节参多糖后含量的比较研究[J].中南药学.2012（6）：421-424.