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【摘要】目的：比较附子不同炮制品（刨附片、炮天雄、黑顺片）对比格犬的心脏急性毒性的影响。方法：比格犬16只，随机分为空白对照组、刨附片组、炮天雄组、黑顺片组，按照4g生药/kg灌胃比格犬浓缩液，检测灌胃前和灌胃后1h，1d、3d、7d和14d后比格犬体重、体温变化和心电图心率变化，并测定血液中乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）的含量。结果：给药后1h内黑顺片组犬出现呕吐，其余组未观察到症状；给药后14d内比格犬体重、体温正常，给药组乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶含量，心电图心率与空白组相比，差异无统计学意义（P>005）。结论：刨附片，炮天雄，黑顺片水煎液按照4g生药/kg给犬灌胃，没有明显心脏毒性。
【关键词】刨附片；炮天雄；黑顺片；比格犬；急性毒性
【中图分类号】R2851【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）16-0021-03
Studies on the Acute Toxicity of Aconitum Carmichaeli Debx Processed products Decoction in Heart of Beagle Dogs
Zhang XueSong YuqinYang YutingHe ShuXie Xiaofang*Peng Cheng
Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，State Key Laboratory Breeding Base of Systematic
Research Development and Utilization of Chinese Medicine Resources，Sichuan Province And
Ministry of Science and Technology，Chengdu 611137，China
Abstract：Objective To investigate and compare the different processed Aconitum carmichaeli （Paofupian， PaoTianxiong， Heishunpian） for acute cardiac toxicity in beagle dogs. Methods sixteen Beagle dogs ， randomly divided into control group， Paofupian group， PaoTianxiong group， Heishunpian group， according to the 4 g crude drug / kg gavaging to Beagles， observe fourteen days， and detect the weight， temperature changing and ECG heart rate and blood lactate measurements dehydrogenase and creatine kinase MB before administration and at one hour、one day 、three day、seven day、fourteen day after administration.Results within one hour after administration ，heishunpian group dogs bagan to vomite，the symptoms were not observed in other groups； fourteen days after administration Beagle dogs’s weight， temperature are normal， comparing the administration groups to the control group，the lactate dehydrogenase and creatine kinase isoenzyme content， ECG heart rate have no significant difference. Conclusion the different processed Aconitum carmichaeli （Paofupian， PaoTianxiong， Heishunpian）decoctions according 4g / kg orally to fill beagle dog’s stomach，have no significant cardiac toxicity.
Keywords：Paofupian； PaoTianxiong； Heishunpian； beagle dog； acute toxicity
附子为毛茛科（Ranunculaceae）植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品。附子始载于《神农本草经》，味辛、甘，性大热，有毒，被誉为“乱世之良将，回阳救逆之第一品，补命门真火第一要药”。但因其性刚烈迅捷，历代医家及本草著作皆言附子“有毒”，用之不当，易出现严重的毒副作用。研究表明附子主要活性成分为二萜类生物碱，包括双酯型、单酯型和脂性生物碱。其中双酯型生物碱毒性最大，其毒性主要作用于中枢神经系统、心脏、和肌肉组织。因此如何合理使用附子成为研究热点。《本草问答》记载，“四川彰明县采制附子，必用盐腌，其腌附子之盐，食之毒人至死，并无药可解，可知附子之毒甚矣。然将腌附子之盐，放于竹筒中用火煅过，则无毒，入补肾药，又温而不烈，反为良药”。表明附子经加工炮制后，可降低毒性，便于内服，为回阳救逆第一品，广受医生和患者青睐。目前，附子作为一种中药商品，其最大的特点在于规格较多，不同的商品体现了精湛复杂的产地加工和炮制技术，一些炮制品甚至被制备药膳或外形美观的保健食品，如炮天雄、刨附片等。为了确保附子炮制品的安全使用，本实验就附子的炮制品刨附片、炮天雄及黑顺片（大中张）的水煎液对比格犬的心脏急性毒性进行研究。 1材料与仪器
11动物比格犬，雌雄各半，75～100kg，7～8月龄，由四川养麝研究所比格犬繁育中心提供，动物质量合格证号SCXK（川）2009-01。检疫后备用。
1.2药物刨附片、炮天雄、黑顺片（大中张）饮片，均由四川省好医生药业有限公司提供，均按以下方法制备水煎液：第一次以10倍量水煎5个h，过滤后再以8倍量水煎3h，混合两次水煎液，浓缩。试验前各药物均浓缩成40g生药/ml。
1.3试剂乳酸脱氢酶（LDH，批号：130706）、肌酸激酶同工酶（CK-MB，批号：228320）试剂盒均由上海华臣生物试剂有限公司提供。
1.4仪器7180型全自动生化分析仪（日本日立）；ACCESS型全自动化学发光分析仪（德国贝克曼公司）；PC-80B型快速心电检测仪（深圳科瑞康实业有限有公司）；电子体温计。
2方法
2.1分组与给药经预试无法测定各试验药物灌胃比格犬的LD50，故进行最大给药量测定。取健康、合格比格 犬16只，适应性饲养1周。随机分为4组，即空白组、刨附片组、炮天雄组、黑顺片组，每组4只犬，雌雄各半。给药前禁食不禁水12h，测定体重、肛温、心电图（肢体II导联）。然后灌胃给药，其中空白组给予蒸馏水，其余各给药组给予相应药液4g生药/kg，给药体积均为20ml/kg。然后密切观察犬的活动、对外界反应、分泌物等一般状态，随后常规饲养14d，每日观察1次。并于给药后1h及1、3、7、14d时测定体重、肛温和心电图变化，同时取血测定血清中LDH、CK-MB含量。
2.2统计学方法数据以SPSS 170统计软件包建立数据库后，采用配对t检验对同组动物给药前后进行比较，采用单因素方差分析比较组间的变化。P<005表示有统计学差异。
3结果
31对比格犬一般状态的影响观察给药后犬的活动，发现3个给药组犬在给药后短时间内表现为精神不振或烦躁，尤其以黑顺片组犬表现明显，且黑顺片组3只犬均出现不同程度呕吐，在给药后10～20min出现，为白色泡沫；随后未见明显异常反应，进食正常；其余组未观察到呕吐症状，进食正常。
32对比格犬体重和肛温的影响附子不同炮制品灌胃后比格犬后经过14d的观察，发现附子不同炮制品组和空白组的犬体重基本保持同步增长的变化，与空白组相比，未见统计学差异。给药后药物对比格犬肛温基本无影响，结果见表1和表2。
33对比格犬心电图的影响刨附片、炮天雄、黑顺片水煎液对比格犬的心电图心率影响不大，其中刨附片组在给药1小时后心率显著加快（P<005），其余组变化不显著（P>005）；给药后14d刨附片组与空白组相比Q-T波明显延长，有统计学差异（P<005）；其余各组的犬Q-T波没有明显差异（P>005）。结果见表3、4、5。
34对比格犬血清LDH、CK-MB的影响比格犬被给药后血清中的LDH含量有变化，但组间比较都没有显著统计学差异，其中黑顺片的乳酸脱氢酶含量在给药后1h，1d和14d均低于空白组，未见统计学差异（P>005）；而空白组和刨附片组和炮天雄组犬血清内肌酸激酶同工酶稳定，黑顺片组比格犬的肌酸激酶同工酶在给药后随着时间的推移逐渐降低，与空白组相比，未见统计学差异（P>005），具体如表6、7。
4讨论
附子为有毒中药，其毒性主要是由双酯型乌头类生物碱引起。研究表明2.5mg/ml以上浓度乌头碱可影响体外大鼠胚胎生长发育和器官形态分化，诱发以心脏和神经系统为主的器官畸形，加入体外代谢活化系统S9可以减轻乌头碱对大鼠胚胎的毒性作用。经炮制、水煎、合理配伍等，双酯型乌头类生物碱含量下降，毒性也明显降低。因此，临床应用通常选择附子的炮制品，而附子的炮制品种类也逐渐增多。附子在加工中，由于药材使用的用途、方式的不同形成了不同的药材商品规格，按照临床使用情况分为可直接使用和半成品两大类。而直接使用的附子商品又按照使用目的的不同，其加工方式也不一样。临床处方使用多为黑顺片、白附片等，制备药膳或保健食品多为外形美观的加工品，如炮附子（炮天雄）、刨附片等。研究发现，附子水煎醇沉液（酯型生物碱乌头碱的含量为00364%）给小鼠灌胃，LD50为31.24g/kg，换算成人临床用量为240.31g/d。给药后即可见部分动物躁动不安、呼吸增强、头部颤动继而全身抽搐，继而蜷卧，体表温度下降，直至死亡。镜检可见中毒死亡小鼠肝脏、肾脏呈暗红色，心肌有轻微瘀血，内有少量积液，其余未见异常。黑顺片水煎液按15、30、45、60、75、90g/kg的剂量给小鼠灌胃，连续10d，60g/kg以上剂量组能使小鼠死亡率显著增加，中毒反应较多且较严重，对心电图也有一定影响，对肝有一定损伤，还可显著降低血尿素氮。但研究集中在3种炮制品对小鼠的急毒情况，现本实验主要探究其对犬的心脏急性毒性。
附子急性心脏毒性反应表现特点为：先出现心率加快和心律不齐，皮肤、尾、足垫发红，体热，心前区搏动明显加快；逐渐转为体凉，唇爪、尾部、耳、足垫苍白，唇爪发绀；最后心前区搏动减弱，心率减慢，死亡。本实验为探讨和比较附子不同炮制品（刨附片、炮天雄、黑顺片）对比格犬的急性心脏毒性，采用标准工艺煎煮刨附片、炮天雄、黑顺片，其水煎液浓度浓缩为40g生药/ml，按照4g生药/kg剂量灌胃比格犬，拟人剂量为160g/次（人以60kg计），除黑顺片组可观察到呕吐外，其余组未出现明显反应，在灌胃一次后14d内比格犬的体温体重均正常，各组犬心电图心率均没有明显差异，对血液中乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶也没有显著影响，说明这3种附子的炮制品刨附片、炮天雄、黑顺片安全性高，在剂量为4g/kg时，附子炮制品刨附片、炮天雄、黑顺片对比格犬未见明显心脏毒性，而刨附片和炮天雄相比黑顺片在等剂量时安全性更高，这可能与炮制工艺相关。
参考文献
[1] 中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国中医药科技出版社，2010：177 -178.
[2] 陈荣昌，孙桂波，张强，等.附子毒性研究进展[J].中国中药杂志，2013，38（8）：1126-1128.
[3] Bisset. Arrow poisons in China part II.aconitum-botany chemistry and pharmacology[J]. J Ethnopharmacol，1981（4）：247.
[4] Bai Y L，Desai H K，Pelletier S W，et al. Long-chain fatty acid esters of some norditerpenoid alkaloids[J]. J Nat Prod，1994（1）：57.
[5] 张智，闪增郁，向丽华，等.15味有毒中药小鼠半数致死量的实验研究[J].中国中医基础医学杂志，2005，11（6） ： 435.
[6] Kai Xiao， Li Wang，Yuqing Liu， et al. Study of aconitine toxicity in rat embryos in vitro[J]. Birth Defects Research （Part B）， 2007（80）：208-212.
[7] 黄勤挽，周子渝，王瑾，等.附子商品规格梳理及形成模式研究[J].成都中医药大学学报，2011，34（2）：83-85.
[8] 张梅，苗维纳，杨明，等.附子抗心律失常有效组分[J].中华国际医学杂志，2001，1（6）：549-556.
[9] 陈金月，周芳，黄世优.大剂量使用附子的安全性研究[J].亚太传统医药，2008，4（10）：37-39.
[10] 谢晓芳.附子心脏毒作用机制研究[D].成都：成都中医药大学，2012：3.
（收稿日期：20150511）
【关键词】刨附片；炮天雄；黑顺片；比格犬；急性毒性
【中图分类号】R2851【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）16-0021-03
Studies on the Acute Toxicity of Aconitum Carmichaeli Debx Processed products Decoction in Heart of Beagle Dogs
Zhang XueSong YuqinYang YutingHe ShuXie Xiaofang*Peng Cheng
Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，State Key Laboratory Breeding Base of Systematic
Research Development and Utilization of Chinese Medicine Resources，Sichuan Province And
Ministry of Science and Technology，Chengdu 611137，China
Abstract：Objective To investigate and compare the different processed Aconitum carmichaeli （Paofupian， PaoTianxiong， Heishunpian） for acute cardiac toxicity in beagle dogs. Methods sixteen Beagle dogs ， randomly divided into control group， Paofupian group， PaoTianxiong group， Heishunpian group， according to the 4 g crude drug / kg gavaging to Beagles， observe fourteen days， and detect the weight， temperature changing and ECG heart rate and blood lactate measurements dehydrogenase and creatine kinase MB before administration and at one hour、one day 、three day、seven day、fourteen day after administration.Results within one hour after administration ，heishunpian group dogs bagan to vomite，the symptoms were not observed in other groups； fourteen days after administration Beagle dogs’s weight， temperature are normal， comparing the administration groups to the control group，the lactate dehydrogenase and creatine kinase isoenzyme content， ECG heart rate have no significant difference. Conclusion the different processed Aconitum carmichaeli （Paofupian， PaoTianxiong， Heishunpian）decoctions according 4g / kg orally to fill beagle dog’s stomach，have no significant cardiac toxicity.
Keywords：Paofupian； PaoTianxiong； Heishunpian； beagle dog； acute toxicity
附子为毛茛科（Ranunculaceae）植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品。附子始载于《神农本草经》，味辛、甘，性大热，有毒，被誉为“乱世之良将，回阳救逆之第一品，补命门真火第一要药”。但因其性刚烈迅捷，历代医家及本草著作皆言附子“有毒”，用之不当，易出现严重的毒副作用。研究表明附子主要活性成分为二萜类生物碱，包括双酯型、单酯型和脂性生物碱。其中双酯型生物碱毒性最大，其毒性主要作用于中枢神经系统、心脏、和肌肉组织。因此如何合理使用附子成为研究热点。《本草问答》记载，“四川彰明县采制附子，必用盐腌，其腌附子之盐，食之毒人至死，并无药可解，可知附子之毒甚矣。然将腌附子之盐，放于竹筒中用火煅过，则无毒，入补肾药，又温而不烈，反为良药”。表明附子经加工炮制后，可降低毒性，便于内服，为回阳救逆第一品，广受医生和患者青睐。目前，附子作为一种中药商品，其最大的特点在于规格较多，不同的商品体现了精湛复杂的产地加工和炮制技术，一些炮制品甚至被制备药膳或外形美观的保健食品，如炮天雄、刨附片等。为了确保附子炮制品的安全使用，本实验就附子的炮制品刨附片、炮天雄及黑顺片（大中张）的水煎液对比格犬的心脏急性毒性进行研究。 1材料与仪器
11动物比格犬，雌雄各半，75～100kg，7～8月龄，由四川养麝研究所比格犬繁育中心提供，动物质量合格证号SCXK（川）2009-01。检疫后备用。
1.2药物刨附片、炮天雄、黑顺片（大中张）饮片，均由四川省好医生药业有限公司提供，均按以下方法制备水煎液：第一次以10倍量水煎5个h，过滤后再以8倍量水煎3h，混合两次水煎液，浓缩。试验前各药物均浓缩成40g生药/ml。
1.3试剂乳酸脱氢酶（LDH，批号：130706）、肌酸激酶同工酶（CK-MB，批号：228320）试剂盒均由上海华臣生物试剂有限公司提供。
1.4仪器7180型全自动生化分析仪（日本日立）；ACCESS型全自动化学发光分析仪（德国贝克曼公司）；PC-80B型快速心电检测仪（深圳科瑞康实业有限有公司）；电子体温计。
2方法
2.1分组与给药经预试无法测定各试验药物灌胃比格犬的LD50，故进行最大给药量测定。取健康、合格比格 犬16只，适应性饲养1周。随机分为4组，即空白组、刨附片组、炮天雄组、黑顺片组，每组4只犬，雌雄各半。给药前禁食不禁水12h，测定体重、肛温、心电图（肢体II导联）。然后灌胃给药，其中空白组给予蒸馏水，其余各给药组给予相应药液4g生药/kg，给药体积均为20ml/kg。然后密切观察犬的活动、对外界反应、分泌物等一般状态，随后常规饲养14d，每日观察1次。并于给药后1h及1、3、7、14d时测定体重、肛温和心电图变化，同时取血测定血清中LDH、CK-MB含量。
2.2统计学方法数据以SPSS 170统计软件包建立数据库后，采用配对t检验对同组动物给药前后进行比较，采用单因素方差分析比较组间的变化。P<005表示有统计学差异。
3结果
31对比格犬一般状态的影响观察给药后犬的活动，发现3个给药组犬在给药后短时间内表现为精神不振或烦躁，尤其以黑顺片组犬表现明显，且黑顺片组3只犬均出现不同程度呕吐，在给药后10～20min出现，为白色泡沫；随后未见明显异常反应，进食正常；其余组未观察到呕吐症状，进食正常。
32对比格犬体重和肛温的影响附子不同炮制品灌胃后比格犬后经过14d的观察，发现附子不同炮制品组和空白组的犬体重基本保持同步增长的变化，与空白组相比，未见统计学差异。给药后药物对比格犬肛温基本无影响，结果见表1和表2。
33对比格犬心电图的影响刨附片、炮天雄、黑顺片水煎液对比格犬的心电图心率影响不大，其中刨附片组在给药1小时后心率显著加快（P<005），其余组变化不显著（P>005）；给药后14d刨附片组与空白组相比Q-T波明显延长，有统计学差异（P<005）；其余各组的犬Q-T波没有明显差异（P>005）。结果见表3、4、5。
34对比格犬血清LDH、CK-MB的影响比格犬被给药后血清中的LDH含量有变化，但组间比较都没有显著统计学差异，其中黑顺片的乳酸脱氢酶含量在给药后1h，1d和14d均低于空白组，未见统计学差异（P>005）；而空白组和刨附片组和炮天雄组犬血清内肌酸激酶同工酶稳定，黑顺片组比格犬的肌酸激酶同工酶在给药后随着时间的推移逐渐降低，与空白组相比，未见统计学差异（P>005），具体如表6、7。
4讨论
附子为有毒中药，其毒性主要是由双酯型乌头类生物碱引起。研究表明2.5mg/ml以上浓度乌头碱可影响体外大鼠胚胎生长发育和器官形态分化，诱发以心脏和神经系统为主的器官畸形，加入体外代谢活化系统S9可以减轻乌头碱对大鼠胚胎的毒性作用。经炮制、水煎、合理配伍等，双酯型乌头类生物碱含量下降，毒性也明显降低。因此，临床应用通常选择附子的炮制品，而附子的炮制品种类也逐渐增多。附子在加工中，由于药材使用的用途、方式的不同形成了不同的药材商品规格，按照临床使用情况分为可直接使用和半成品两大类。而直接使用的附子商品又按照使用目的的不同，其加工方式也不一样。临床处方使用多为黑顺片、白附片等，制备药膳或保健食品多为外形美观的加工品，如炮附子（炮天雄）、刨附片等。研究发现，附子水煎醇沉液（酯型生物碱乌头碱的含量为00364%）给小鼠灌胃，LD50为31.24g/kg，换算成人临床用量为240.31g/d。给药后即可见部分动物躁动不安、呼吸增强、头部颤动继而全身抽搐，继而蜷卧，体表温度下降，直至死亡。镜检可见中毒死亡小鼠肝脏、肾脏呈暗红色，心肌有轻微瘀血，内有少量积液，其余未见异常。黑顺片水煎液按15、30、45、60、75、90g/kg的剂量给小鼠灌胃，连续10d，60g/kg以上剂量组能使小鼠死亡率显著增加，中毒反应较多且较严重，对心电图也有一定影响，对肝有一定损伤，还可显著降低血尿素氮。但研究集中在3种炮制品对小鼠的急毒情况，现本实验主要探究其对犬的心脏急性毒性。
附子急性心脏毒性反应表现特点为：先出现心率加快和心律不齐，皮肤、尾、足垫发红，体热，心前区搏动明显加快；逐渐转为体凉，唇爪、尾部、耳、足垫苍白，唇爪发绀；最后心前区搏动减弱，心率减慢，死亡。本实验为探讨和比较附子不同炮制品（刨附片、炮天雄、黑顺片）对比格犬的急性心脏毒性，采用标准工艺煎煮刨附片、炮天雄、黑顺片，其水煎液浓度浓缩为40g生药/ml，按照4g生药/kg剂量灌胃比格犬，拟人剂量为160g/次（人以60kg计），除黑顺片组可观察到呕吐外，其余组未出现明显反应，在灌胃一次后14d内比格犬的体温体重均正常，各组犬心电图心率均没有明显差异，对血液中乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶也没有显著影响，说明这3种附子的炮制品刨附片、炮天雄、黑顺片安全性高，在剂量为4g/kg时，附子炮制品刨附片、炮天雄、黑顺片对比格犬未见明显心脏毒性，而刨附片和炮天雄相比黑顺片在等剂量时安全性更高，这可能与炮制工艺相关。
参考文献
[1] 中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国中医药科技出版社，2010：177 -178.
[2] 陈荣昌，孙桂波，张强，等.附子毒性研究进展[J].中国中药杂志，2013，38（8）：1126-1128.
[3] Bisset. Arrow poisons in China part II.aconitum-botany chemistry and pharmacology[J]. J Ethnopharmacol，1981（4）：247.
[4] Bai Y L，Desai H K，Pelletier S W，et al. Long-chain fatty acid esters of some norditerpenoid alkaloids[J]. J Nat Prod，1994（1）：57.
[5] 张智，闪增郁，向丽华，等.15味有毒中药小鼠半数致死量的实验研究[J].中国中医基础医学杂志，2005，11（6） ： 435.
[6] Kai Xiao， Li Wang，Yuqing Liu， et al. Study of aconitine toxicity in rat embryos in vitro[J]. Birth Defects Research （Part B）， 2007（80）：208-212.
[7] 黄勤挽，周子渝，王瑾，等.附子商品规格梳理及形成模式研究[J].成都中医药大学学报，2011，34（2）：83-85.
[8] 张梅，苗维纳，杨明，等.附子抗心律失常有效组分[J].中华国际医学杂志，2001，1（6）：549-556.
[9] 陈金月，周芳，黄世优.大剂量使用附子的安全性研究[J].亚太传统医药，2008，4（10）：37-39.
[10] 谢晓芳.附子心脏毒作用机制研究[D].成都：成都中医药大学，2012：3.
（收稿日期：20150511）