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【摘要】目的：建立肝素钠原料中EDTA-2Na的残留测定方法。方法：色谱柱：WondaSil-C18 （200mm×46mm×5μm）；流动相：pH为30的0025mol/l硫酸铵溶液；检测波长：254nm；检测温度：室温；流速：10ml/min；进样量：20μl。结果：EDTA-2Na在01～1.5μg/ml浓度范围内具有良好的线性关系，平均回收率为10009%，RSD为10%。结论：本法测定肝素钠中EDTA-2Na具有良好的专属性、线性、重复性和准确度，适用于EDTA-2Na的检测。
【关键词】肝素钠；EDTA-2Na；残留测定
【中图分类号】R943【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）16-0028-02
肝素钠是从猪小肠黏膜中提取精制的含有硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属于不均一的多糖分子，通常分子量在3000～30000道尔顿，临床常作为注射剂使用。肝素钠本身带负电荷，能干扰血凝过程的许多环节，其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）结合，而增强后者对活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用。具体涉及阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白。肝素钠作为原料药，中国药典中明确规定了其重金属限度的检测，但由于其来源于动物组织提取，实际生产工艺中均要增加去除重金属的工艺。目前多采用添加EDTA-2Na来螯合重金属，形成水溶物后，经分级沉淀步骤去除螯合物。EDTA-2Na收载于FDA《非活性组分指南》，可用于非注射和注射给药制剂，会与人体内的钙离子形成螯合物，引起低血钙等症状。由于肝素钠生产过程中使用EDTA-2Na去除重金属，所以在终产品中可能残留EDTA-2Na，对其进行检测有重要的意义。
1仪器与材料
11仪器TG332A型分析天平（湘仪天平仪器设备有限公司）；LC-15C型高效液相色谱仪（日本岛津）；LC-20AD型紫外检测器（日本岛津）；
1.2材料硫酸铜（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；EDTA-2Na（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；肝素钠（注射级，批号：HM120401、HM120402、HM120403，石家庄市协和药业有限公司）。水为自制纯化水（二级反渗透法）。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填料WondaSilC18（200mm×46mm×5μm）；流动相：0025mol/l硫酸铜溶液（用稀硫酸调节pH至30）；检测波长：254nm；流速：10ml/min；检测温度：室温；进样量：20μl。
2.2溶液的制备
2.2.1空白溶液的制备精密量取004mol/l硫酸铜溶液10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
2.22对照品未络合溶液的制备精密称取EDTA-2Na 10mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.3供试品未络合溶液的制备精密称取供试品100mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.4对照品溶液的制备精密量取10ml对照品未络合溶液，置100ml量瓶中，再精密加入004 mol/l硫酸铜溶液10ml，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.5供试品溶液的制备精密称取供试品100mg，置100ml量瓶中，再精密加入004 mol/l硫酸铜溶液10ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3系统适用性试验按照2010年版《中国药典》二部附录VD高效液相色谱法，检测波长254nm，分别精密量取空白溶液、供试品溶液、对照品溶液、对照品未络合液、供试品未络合液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。
由图1可知，在此色谱条件下，EDTA-2Na经硫酸铜络合后在254nm处有吸收，硫酸铜与EDTA-2Na峰可完全分离，分离度大于1.5，主峰峰形较好，理论塔板数大于2000，并且单独的硫酸铜、EDTA-2Na、肝素钠均不干扰测定因此，本方法系统适用性、专属性良好。
2.4流动相溶液 pH值考察采用不同pH进行EDTA-2Na检查，精密量取对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，考察pH值对本品EDTA-2Na的影响。由表1可知，pH值对对照品的峰面积无影响，且不同pH值条件下的理论塔板数均大于2000，具有良好的系统适用性。
2.5线性考察分别精密量取对照品溶液01、05、10、1.25、1.5 ml置100ml量瓶中，精密加入004 mol/l硫酸铜溶液10ml，加水稀释至刻度，摇匀，分别制成每1ml溶液中含01、05、10、1.25、1.5μg的对照品溶液，分别精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。得线性方程为：y=105938043x-3298098，r=09999。结果表明，EDTA-2Na在01～1.5μg/ml范围内具有良好的线性关系。
2.6精密度实验平行配制对照品溶液6份，按照上述色谱条件进针测定样品中EDTA-2Na的含量，RSD为026%。说明仪器的精密度良好。
2.7重复性试验取同一批样品，平行制备6份，同法测定，结果RSD为042%，重现性较好，符合验证方案的要求。
28稳定性实验对照品溶液和供试品溶液置室温放置，分别于0、1、2、3、4h测定。结果表明样品溶液在4h内稳定。
29回收率实验为确定本测定方法的准确度，进行了加样回收率试验。EDTA-2Na贮备液的制备：精密称取10mg EDTA-2Na，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。120%回收率溶液的制备：精密称取供试品50mg，置50ml量瓶中，精密加入EDTA贮备液1.2ml，精密加入004 mol/l硫酸铜溶液10ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法分别吸取贮备液10ml及08ml配制100%回收率溶液和80%回收率溶液。分别精密量取以上溶液各20μl注入液相色谱仪，计算回收率。由表2可知，该方法测定回收率其平均回收率为 10009%，RSD为 10%，表明本方法用于EDTA-2Na测定具有较好的准确度。
2.10检测限及定量限取对照品溶液，加水不断稀释至适宜浓度，以信噪比为3∶[KG-*3/5]1时的浓度确定检测限，测得为005μg/ml；以信噪比为10∶[KG-*2]1时的浓度确定定量限，测得为01μg/ml。
2.11样品测定按照上述所确定的色谱方法检测批号为HM120401、HM120402、HM120403中的EDTA-2Na残留量，三批样品分别为001%，001%，000%。
3讨论
EDTA-2Na的检测方法较多，常用的有滴定法和比色法，但这些方法的选择性不高，专属性不好。本研究选用专属性较好的HPLC法来测定，回收率较好，准确度高，符合验证方法的要求。另外，铜离子可与EDTA-2Na形成较为稳定的螯合物，保证了室温放置4h其性质不变。综上所述，HPLC法检测EDTA-2Na的残留具有很好的灵敏度，准确度，简单方便。
参考文献
[1]于广利，赵峡.糖药物学[M].青岛：中国海洋大学出版社，2012：315-320.
[2]郑俊民.药用辅料手册[M].北京：化学工业出版社，2005：263.
[3]Lon HALL， L loyd Takahash. determination of disodium edetate in ophthalmic and contact lens care solutions by reversed phase hight performance liquid chrom- atography [J]. J Pharm S ci， 1988，77（ 3） ：247.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典二部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录VD.
[5]罗祎，赵永彪，李淑娟，等.反相高效液相色谱法测定食品中EDTA的含量[J].中国食品添加剂，2006，17（4）：156.
（收稿日期：20150515）
【关键词】肝素钠；EDTA-2Na；残留测定
【中图分类号】R943【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）16-0028-02
肝素钠是从猪小肠黏膜中提取精制的含有硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属于不均一的多糖分子，通常分子量在3000～30000道尔顿，临床常作为注射剂使用。肝素钠本身带负电荷，能干扰血凝过程的许多环节，其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）结合，而增强后者对活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用。具体涉及阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白。肝素钠作为原料药，中国药典中明确规定了其重金属限度的检测，但由于其来源于动物组织提取，实际生产工艺中均要增加去除重金属的工艺。目前多采用添加EDTA-2Na来螯合重金属，形成水溶物后，经分级沉淀步骤去除螯合物。EDTA-2Na收载于FDA《非活性组分指南》，可用于非注射和注射给药制剂，会与人体内的钙离子形成螯合物，引起低血钙等症状。由于肝素钠生产过程中使用EDTA-2Na去除重金属，所以在终产品中可能残留EDTA-2Na，对其进行检测有重要的意义。
1仪器与材料
11仪器TG332A型分析天平（湘仪天平仪器设备有限公司）；LC-15C型高效液相色谱仪（日本岛津）；LC-20AD型紫外检测器（日本岛津）；
1.2材料硫酸铜（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；EDTA-2Na（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；肝素钠（注射级，批号：HM120401、HM120402、HM120403，石家庄市协和药业有限公司）。水为自制纯化水（二级反渗透法）。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填料WondaSilC18（200mm×46mm×5μm）；流动相：0025mol/l硫酸铜溶液（用稀硫酸调节pH至30）；检测波长：254nm；流速：10ml/min；检测温度：室温；进样量：20μl。
2.2溶液的制备
2.2.1空白溶液的制备精密量取004mol/l硫酸铜溶液10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
2.22对照品未络合溶液的制备精密称取EDTA-2Na 10mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.3供试品未络合溶液的制备精密称取供试品100mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.4对照品溶液的制备精密量取10ml对照品未络合溶液，置100ml量瓶中，再精密加入004 mol/l硫酸铜溶液10ml，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.5供试品溶液的制备精密称取供试品100mg，置100ml量瓶中，再精密加入004 mol/l硫酸铜溶液10ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3系统适用性试验按照2010年版《中国药典》二部附录VD高效液相色谱法，检测波长254nm，分别精密量取空白溶液、供试品溶液、对照品溶液、对照品未络合液、供试品未络合液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。
由图1可知，在此色谱条件下，EDTA-2Na经硫酸铜络合后在254nm处有吸收，硫酸铜与EDTA-2Na峰可完全分离，分离度大于1.5，主峰峰形较好，理论塔板数大于2000，并且单独的硫酸铜、EDTA-2Na、肝素钠均不干扰测定因此，本方法系统适用性、专属性良好。
2.4流动相溶液 pH值考察采用不同pH进行EDTA-2Na检查，精密量取对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，考察pH值对本品EDTA-2Na的影响。由表1可知，pH值对对照品的峰面积无影响，且不同pH值条件下的理论塔板数均大于2000，具有良好的系统适用性。
2.5线性考察分别精密量取对照品溶液01、05、10、1.25、1.5 ml置100ml量瓶中，精密加入004 mol/l硫酸铜溶液10ml，加水稀释至刻度，摇匀，分别制成每1ml溶液中含01、05、10、1.25、1.5μg的对照品溶液，分别精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。得线性方程为：y=105938043x-3298098，r=09999。结果表明，EDTA-2Na在01～1.5μg/ml范围内具有良好的线性关系。
2.6精密度实验平行配制对照品溶液6份，按照上述色谱条件进针测定样品中EDTA-2Na的含量，RSD为026%。说明仪器的精密度良好。
2.7重复性试验取同一批样品，平行制备6份，同法测定，结果RSD为042%，重现性较好，符合验证方案的要求。
28稳定性实验对照品溶液和供试品溶液置室温放置，分别于0、1、2、3、4h测定。结果表明样品溶液在4h内稳定。
29回收率实验为确定本测定方法的准确度，进行了加样回收率试验。EDTA-2Na贮备液的制备：精密称取10mg EDTA-2Na，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。120%回收率溶液的制备：精密称取供试品50mg，置50ml量瓶中，精密加入EDTA贮备液1.2ml，精密加入004 mol/l硫酸铜溶液10ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法分别吸取贮备液10ml及08ml配制100%回收率溶液和80%回收率溶液。分别精密量取以上溶液各20μl注入液相色谱仪，计算回收率。由表2可知，该方法测定回收率其平均回收率为 10009%，RSD为 10%，表明本方法用于EDTA-2Na测定具有较好的准确度。
2.10检测限及定量限取对照品溶液，加水不断稀释至适宜浓度，以信噪比为3∶[KG-*3/5]1时的浓度确定检测限，测得为005μg/ml；以信噪比为10∶[KG-*2]1时的浓度确定定量限，测得为01μg/ml。
2.11样品测定按照上述所确定的色谱方法检测批号为HM120401、HM120402、HM120403中的EDTA-2Na残留量，三批样品分别为001%，001%，000%。
3讨论
EDTA-2Na的检测方法较多，常用的有滴定法和比色法，但这些方法的选择性不高，专属性不好。本研究选用专属性较好的HPLC法来测定，回收率较好，准确度高，符合验证方法的要求。另外，铜离子可与EDTA-2Na形成较为稳定的螯合物，保证了室温放置4h其性质不变。综上所述，HPLC法检测EDTA-2Na的残留具有很好的灵敏度，准确度，简单方便。
参考文献
[1]于广利，赵峡.糖药物学[M].青岛：中国海洋大学出版社，2012：315-320.
[2]郑俊民.药用辅料手册[M].北京：化学工业出版社，2005：263.
[3]Lon HALL， L loyd Takahash. determination of disodium edetate in ophthalmic and contact lens care solutions by reversed phase hight performance liquid chrom- atography [J]. J Pharm S ci， 1988，77（ 3） ：247.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典二部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录VD.
[5]罗祎，赵永彪，李淑娟，等.反相高效液相色谱法测定食品中EDTA的含量[J].中国食品添加剂，2006，17（4）：156.
（收稿日期：20150515）