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【摘要】目的：建立百癣夏塔热软膏高效液相色谱测定方法，并考察该制剂的稳定性。方法：采用高效液相色谱法测定软膏中槲皮素和没食子酸的含量，考察湿度、光照及温度对百癣夏塔热软膏稳定性的影响。结果：槲皮素在004 ～04μg/ml范围内线性关系良好；没食子酸在002～02μg/ml范围内线性关系良好；百癣夏塔热软膏对湿度和强光照射不敏感；于40℃、75%湿度下加速实验，第6个月外观发生变化，含量明显下降。结论：建立的方法具有简便、快速和准确度高等优点；该制剂对强光及高湿不敏感，室温密闭保存含量稳定。
【关键词】百癣夏塔热软膏；槲皮素；没食子酸；高效液相色谱法；稳定性
【中图分类号】R2841【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）16-0026-02
百癣夏塔热软膏为外用制剂，处方来源于《中华人民共和国卫生部药品标准—维吾尔分册》中收载的传统维药百癣夏塔热片。具有清除异常粘液质、胆液质及败血，消肿止痒的功效。临床用于治疗手癣、体癣、足癣、花斑癣、银屑病、过敏性皮炎、带状疱疹、痤疮等。方中君药地锦草的主要有效成分为槲皮素，诃子肉、毛诃子肉、西青果的主要有效成分均为没食子酸，所以我们选用槲皮素和没食子酸作为含量测定指标，本实验采用高效液相色谱法（HPLC）测定软膏中槲皮素和没食子酸的含量，并考察光照、温度及湿度等因素对百癣夏塔热软膏稳定性的影响。
1仪器与材料
11仪器LC2010A HT高效液相色谱仪（日本岛津）；BT25S十万分之一分析天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）。
1.2材料槲皮素对照品（批号：100081-200406）、没食子酸对照品（批号：11083-200302）均由中国药品生物制品检定所提供。百癣夏塔热软膏（批号：130320、130321、130322，新疆奇康哈博维药有限公司研究院）。甲醇为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。
2槲皮素的含量测定
2.1色谱条件色谱柱：Kromasil 100-5 C18 column（150mm×46mm）；流动相：甲醇-04%磷酸溶液（50：50）；柱温：25℃；流速：1ml/min；检测波长：370nm。
2.2供试品溶液的制备取百癣夏塔热软膏约1g，精密称定，至具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50ml，称定重量，置于80℃水浴中保持10min，并不停震荡，滤过，取续滤液即得。
2.3标准曲线的绘制精密称取槲皮素对照品5mg，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液1、2、4、6、8、10ml移至25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别取进样10μl测定。以进样量（x）对峰面积（y）作图，得到标准曲线图，其回归方程为y=162769x+395085，r=09998（n=6）。表明槲皮素在004 ～04μg/ml范围内线性关系良好。
2.4精密度实验分别配制高、低2种浓度的槲皮素对照品各5份，分别测定，测定槲皮素峰面积，结果RSD值分别为071%和053%。说明仪器的精密度良好。
2.5稳定性实验取同一供试品溶液，室温密闭放置，分别于0、2、4、6、8h进样10μl，测定槲皮素的峰面积，RSD为087%（n=5），说明样品在8h内较为稳定。
2.6重复性实验取同一批样品5份，按“2.2”的方法制成供试品溶液，测定槲皮素的平均峰面积，RSD为072%（n=5）。
2.7加样回收率实验精密称取槲皮素对照品6mg，加入到10g乳膏剂基质中，充分研磨均匀，再精密称取该样品1g，溶于50ml 80%甲醇中，置于80℃水浴中保持10min，并不停震荡，滤过，取续滤液10μl注入液相色谱仪，计算回收率，结果见表1。
28样品测定取3批百癣夏塔热软膏按“2.2”的方法制成供试品溶液，测得3批样品中槲皮素的含量，结果见表2。
3没食子酸的含量测定
31色谱条件色谱柱：Kromasil 100-5 C18 column（250mm×46mm）；流动相：甲醇-01%磷酸溶液（10：90）；柱温：25℃；流速：1ml/min；检测波长：270nm。
32供试品溶液的制备 取百癣夏塔热软膏约1g，精密称定，至具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。
33标准曲线的绘制精密称取没食子酸对照品5mg，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液1、2、4、6、8、10ml移至50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样10μl测定。以进样量（x）对峰面积（y）作图，得到标准曲线图，其回归方程为y=15128x+478660，r=09996（n=6）。表明没食子酸在002～02μg/ml范围内线性关系良好。
34精密度实验分别配制高、低2种浓度的槲皮素对照品各5份，分别测定，测定没食子酸的峰面积，结果RSD值分别为052%和047%，说明仪器的精密度良好。
35稳定性实验取同一供试品溶液，室温密闭放置，分别于0、2、4、6、8h进样10μl，测定没食子酸的峰面积，RSD为059%（n=5），说明样品在8h内较为稳定。
36重复性实验取同一批样品5份，按“32”的方法制成供试品溶液，测得没食子酸的峰面积，RSD为093%（n=5）。
37加样回收率实验精密称取没食子酸标准品5mg，加入到10g适量乳膏剂基质中，充分研磨均匀；再精密称取该样品1g，精密加入50ml 50%甲醇，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液10μl注入液相色谱仪，计算回收率，结果见表2。 38样品测定取3批百癣夏塔热软膏按32的方法制成供试品溶液，测得3批样品中没食子酸的含量，结果见表3。
4稳定性实验
4.1高湿度实验取本品适量（约5g），置于平皿中，在25℃、相对湿度75%条件下敞口放置10天，测定各项指标并与实验开始时样品进行比较，未见明显变化。结果见表6。
4.2强光照射实验取本品适量，置于平皿中，在4000Lx光照度下照射10d。在此期间，分别于0、1、3、5、10d取样检验，除软膏有硬化现象且色泽加深外，含量无明显变化。结果见表4。
4.3高温高湿加速实验取本品适量，装入固体药用高密度聚乙烯瓶加盖密闭保存，在温度（40±2）℃，湿度（75±5）%下放置6个月，分别于0、1、2、3、6个月末取样，测定各项指标，结果见表5。
4.4低温实验取本品适量，装入固体药用高密度聚乙烯瓶加盖密闭保存，于（-15±1）℃放置24h，取出后至室温时测定各项指标并与实验开始时的样品比较，均无明显变化，结果见表6。
5讨论
地锦草为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd或斑地锦Euphorbia maculata L的干燥全草，具清热解毒，凉血止血，利湿退黄的功效。研究表明，地锦草含有黄酮、三萜、甾醇、香豆素、鞣质及酚酸类等化合物，对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、乙型链球菌均有明显抑制作用，对甲型链球菌亦有抑菌作用。因此，实验采用高效液相色谱法测定其主要成分槲皮素的含量。另外，诃子、毛诃子肉、西青果等都含有没食子酸，因此以没食子酸作为控制西青果、诃子等药材的限量。由于芦荟苷不稳定，容易受到各种因素的影响而发生转化，方中芦荟的定量还待进一步研究。
文献分别测定了百癣夏塔热胶囊中没食子酸的含量和百癣夏塔热片中槲皮素的含量，本文采用高效液相色谱法测定了百癣夏塔热软膏中的槲皮素及没食子酸的含量，建立的方法稳定、可靠、易操作，为百癣夏塔热软膏质量控制奠定了一定的研究基础。同时，该软膏的稳定性考察表明，百癣夏塔热软膏在高湿、低温条件下外观未改变，槲皮素及没食子酸的含量稳定；该制剂在生产加工时不宜长时间暴露于强光下；不宜在高温下长期存放。因此，在生产、存储时为避免药物性状发生改变，应注意不宜长时间暴露在强光下，包装应严密。而长期稳定性还需进一步研究。
参考文献
[1] 李雪君，玛依努，王瑞芳，等.百癣夏塔热软膏的工艺研究[J].中国实用医药，2013，10（8）：240.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：1.
[3] 谢奇，李治建.地锦草化学成分及其抗真菌作用的研究进展[J].医药导报，2011.7（30）：880-883.
[4] 柏雪莲，宓伟.地锦草体外抑菌作用研究[J].时珍国医国药，2007，18（8）：2747.
[5] 王双，王昌涛，都晓伟.诃子中活性物质的提取及其抗氧化、抑菌作用研究[J].食品与机械，2010，11（26）：71-74.
[6] 李坤.西青果治疗感染性创面的有效组分及作用机制研究[D].大连：辽宁师范大学，2012.
[7] 蔡小华，谢兵，杜海军.诃子化学成分及药理作用的研究进展[J].药学进展，2008，（32）：213-215.
[8] 王晓飞，金向群.高效液相色谱法测定百癣夏塔热胶囊中没食子酸的含量[J].时珍国医国药，2006，17（2）：194.
[9] 甘书明，王树瑶.高效液相色谱法测定百癣夏塔热片中槲皮素的含量[J].黑龙江医药，2014，5（27）：1020.
（收稿日期：20150515）
【关键词】百癣夏塔热软膏；槲皮素；没食子酸；高效液相色谱法；稳定性
【中图分类号】R2841【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）16-0026-02
百癣夏塔热软膏为外用制剂，处方来源于《中华人民共和国卫生部药品标准—维吾尔分册》中收载的传统维药百癣夏塔热片。具有清除异常粘液质、胆液质及败血，消肿止痒的功效。临床用于治疗手癣、体癣、足癣、花斑癣、银屑病、过敏性皮炎、带状疱疹、痤疮等。方中君药地锦草的主要有效成分为槲皮素，诃子肉、毛诃子肉、西青果的主要有效成分均为没食子酸，所以我们选用槲皮素和没食子酸作为含量测定指标，本实验采用高效液相色谱法（HPLC）测定软膏中槲皮素和没食子酸的含量，并考察光照、温度及湿度等因素对百癣夏塔热软膏稳定性的影响。
1仪器与材料
11仪器LC2010A HT高效液相色谱仪（日本岛津）；BT25S十万分之一分析天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）。
1.2材料槲皮素对照品（批号：100081-200406）、没食子酸对照品（批号：11083-200302）均由中国药品生物制品检定所提供。百癣夏塔热软膏（批号：130320、130321、130322，新疆奇康哈博维药有限公司研究院）。甲醇为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。
2槲皮素的含量测定
2.1色谱条件色谱柱：Kromasil 100-5 C18 column（150mm×46mm）；流动相：甲醇-04%磷酸溶液（50：50）；柱温：25℃；流速：1ml/min；检测波长：370nm。
2.2供试品溶液的制备取百癣夏塔热软膏约1g，精密称定，至具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50ml，称定重量，置于80℃水浴中保持10min，并不停震荡，滤过，取续滤液即得。
2.3标准曲线的绘制精密称取槲皮素对照品5mg，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液1、2、4、6、8、10ml移至25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别取进样10μl测定。以进样量（x）对峰面积（y）作图，得到标准曲线图，其回归方程为y=162769x+395085，r=09998（n=6）。表明槲皮素在004 ～04μg/ml范围内线性关系良好。
2.4精密度实验分别配制高、低2种浓度的槲皮素对照品各5份，分别测定，测定槲皮素峰面积，结果RSD值分别为071%和053%。说明仪器的精密度良好。
2.5稳定性实验取同一供试品溶液，室温密闭放置，分别于0、2、4、6、8h进样10μl，测定槲皮素的峰面积，RSD为087%（n=5），说明样品在8h内较为稳定。
2.6重复性实验取同一批样品5份，按“2.2”的方法制成供试品溶液，测定槲皮素的平均峰面积，RSD为072%（n=5）。
2.7加样回收率实验精密称取槲皮素对照品6mg，加入到10g乳膏剂基质中，充分研磨均匀，再精密称取该样品1g，溶于50ml 80%甲醇中，置于80℃水浴中保持10min，并不停震荡，滤过，取续滤液10μl注入液相色谱仪，计算回收率，结果见表1。
28样品测定取3批百癣夏塔热软膏按“2.2”的方法制成供试品溶液，测得3批样品中槲皮素的含量，结果见表2。
3没食子酸的含量测定
31色谱条件色谱柱：Kromasil 100-5 C18 column（250mm×46mm）；流动相：甲醇-01%磷酸溶液（10：90）；柱温：25℃；流速：1ml/min；检测波长：270nm。
32供试品溶液的制备 取百癣夏塔热软膏约1g，精密称定，至具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。
33标准曲线的绘制精密称取没食子酸对照品5mg，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液1、2、4、6、8、10ml移至50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样10μl测定。以进样量（x）对峰面积（y）作图，得到标准曲线图，其回归方程为y=15128x+478660，r=09996（n=6）。表明没食子酸在002～02μg/ml范围内线性关系良好。
34精密度实验分别配制高、低2种浓度的槲皮素对照品各5份，分别测定，测定没食子酸的峰面积，结果RSD值分别为052%和047%，说明仪器的精密度良好。
35稳定性实验取同一供试品溶液，室温密闭放置，分别于0、2、4、6、8h进样10μl，测定没食子酸的峰面积，RSD为059%（n=5），说明样品在8h内较为稳定。
36重复性实验取同一批样品5份，按“32”的方法制成供试品溶液，测得没食子酸的峰面积，RSD为093%（n=5）。
37加样回收率实验精密称取没食子酸标准品5mg，加入到10g适量乳膏剂基质中，充分研磨均匀；再精密称取该样品1g，精密加入50ml 50%甲醇，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液10μl注入液相色谱仪，计算回收率，结果见表2。 38样品测定取3批百癣夏塔热软膏按32的方法制成供试品溶液，测得3批样品中没食子酸的含量，结果见表3。
4稳定性实验
4.1高湿度实验取本品适量（约5g），置于平皿中，在25℃、相对湿度75%条件下敞口放置10天，测定各项指标并与实验开始时样品进行比较，未见明显变化。结果见表6。
4.2强光照射实验取本品适量，置于平皿中，在4000Lx光照度下照射10d。在此期间，分别于0、1、3、5、10d取样检验，除软膏有硬化现象且色泽加深外，含量无明显变化。结果见表4。
4.3高温高湿加速实验取本品适量，装入固体药用高密度聚乙烯瓶加盖密闭保存，在温度（40±2）℃，湿度（75±5）%下放置6个月，分别于0、1、2、3、6个月末取样，测定各项指标，结果见表5。
4.4低温实验取本品适量，装入固体药用高密度聚乙烯瓶加盖密闭保存，于（-15±1）℃放置24h，取出后至室温时测定各项指标并与实验开始时的样品比较，均无明显变化，结果见表6。
5讨论
地锦草为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd或斑地锦Euphorbia maculata L的干燥全草，具清热解毒，凉血止血，利湿退黄的功效。研究表明，地锦草含有黄酮、三萜、甾醇、香豆素、鞣质及酚酸类等化合物，对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、乙型链球菌均有明显抑制作用，对甲型链球菌亦有抑菌作用。因此，实验采用高效液相色谱法测定其主要成分槲皮素的含量。另外，诃子、毛诃子肉、西青果等都含有没食子酸，因此以没食子酸作为控制西青果、诃子等药材的限量。由于芦荟苷不稳定，容易受到各种因素的影响而发生转化，方中芦荟的定量还待进一步研究。
文献分别测定了百癣夏塔热胶囊中没食子酸的含量和百癣夏塔热片中槲皮素的含量，本文采用高效液相色谱法测定了百癣夏塔热软膏中的槲皮素及没食子酸的含量，建立的方法稳定、可靠、易操作，为百癣夏塔热软膏质量控制奠定了一定的研究基础。同时，该软膏的稳定性考察表明，百癣夏塔热软膏在高湿、低温条件下外观未改变，槲皮素及没食子酸的含量稳定；该制剂在生产加工时不宜长时间暴露于强光下；不宜在高温下长期存放。因此，在生产、存储时为避免药物性状发生改变，应注意不宜长时间暴露在强光下，包装应严密。而长期稳定性还需进一步研究。
参考文献
[1] 李雪君，玛依努，王瑞芳，等.百癣夏塔热软膏的工艺研究[J].中国实用医药，2013，10（8）：240.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：1.
[3] 谢奇，李治建.地锦草化学成分及其抗真菌作用的研究进展[J].医药导报，2011.7（30）：880-883.
[4] 柏雪莲，宓伟.地锦草体外抑菌作用研究[J].时珍国医国药，2007，18（8）：2747.
[5] 王双，王昌涛，都晓伟.诃子中活性物质的提取及其抗氧化、抑菌作用研究[J].食品与机械，2010，11（26）：71-74.
[6] 李坤.西青果治疗感染性创面的有效组分及作用机制研究[D].大连：辽宁师范大学，2012.
[7] 蔡小华，谢兵，杜海军.诃子化学成分及药理作用的研究进展[J].药学进展，2008，（32）：213-215.
[8] 王晓飞，金向群.高效液相色谱法测定百癣夏塔热胶囊中没食子酸的含量[J].时珍国医国药，2006，17（2）：194.
[9] 甘书明，王树瑶.高效液相色谱法测定百癣夏塔热片中槲皮素的含量[J].黑龙江医药，2014，5（27）：1020.
（收稿日期：20150515）