论文部分内容阅读
【摘要】 目的：应用雷米普利治疗2型糖尿病（T2DM）的肾病患者，比较治疗前、后尿足细胞数量的变化，并探讨雷米普利对肾脏的保护机制。方法：选取56例糖尿病肾病（DN）微量白蛋白尿期的患者，随机分为治疗组和对照组。治疗组每日给予雷米普利5 mg，连续服用3个月。应用小鼠抗人肾小球足细胞特异性蛋白（Podocalyxin， PCX）单克隆抗体，采用间接免疫荧光技术检测尿中PCX阳性染色细胞，计数尿足细胞数量。比较治疗前、后两组的尿足细胞数量。结果：雷米普利治疗组的尿足细胞数量较基线明显下降（P<0.05），与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论：雷米普利可以减少DN患者的尿足细胞数量，保护肾功能。
【关键词】 糖尿病肾病； 足细胞； 雷米普利
Effects of Ramipril on Urinary Podocyte Number in Patients with Diabetic Nephropathy/FENG Qiu-xia， CHENG Li-jing， LU Lu， et al.//Medical Innovation of China，2013，10（15）：008-010
【Abstract】 Objective： To compare ramipril treatment of type 2 diabetes mellitus（T2DM） patients with nephropathy before and after urine enough to the change of the number of cells and to explore ramipril kidney protection mechanisms. Method： 56 patients with diabetic nephropathy（DN） microalbuminuria were randomly divided into treatment group and control group. The treatment group was given daily ramipril 5 mg， taking three consecutive months. Applications mouse anti-human monoclonal antibody podocyte-specific protein （Podocalyxin， PCX）， positively stained cells using indirect immunofluorescence to detect urinary PCX， count the number of urinary podocytes. To compare the number of urinary podocytes pre-treatment. Result： The number of urinary podocytes ramipril treatment group compared with the baseline decreased significantly（P<0.05）， compared with the control group， there was a significant difference（P<0.05）. Conclusion： Ramipril can reduce the number of urinary podocytes DN patients and protect renal function.
【Key words】 Diabetic Nephropathy； Urinary podocytes； Ramipril
First-author’s address： Dalian Municipal Central Hospital， Dalian 116011， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.15.003
糖尿病肾病的早期发现和早期治疗对于改善糖尿病患者的预后十分重要。足细胞是肾小球脏层上皮细胞，足细胞损伤与DN的蛋白尿产生及肾小球硬化有关[1]。近年研究发现，受损的足细胞可以从肾小球基底膜脱落，导致肾脏的足细胞数量减少而损害了肾脏的正常生理功能[2]。本研究通过观察血管紧张素酶抑制剂（ACEI）雷米普利对DN患者尿足细胞数量的影响，探讨雷米普利保护肾脏的机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料 按照1999年WHO诊断标准，收集本院2009年-2010年门诊和住院的56例2型糖尿病合并糖尿病肾病微量白蛋白尿期的患者（24 h尿白蛋白排泄率在20～200 μg/min之间，内生肌酐清除率>90 ml/min），除外合并糖尿病急性并发症，应激，恶性肿瘤，正在服用或半年内服用过血管紧张素酶抑制剂（ACEI） 或血管紧张素受体拮抗剂（ARB）、他汀类、噻唑脘二酮类的患者（空腹血糖<10.0 mmol/L）。所有DN患者随机分为治疗组29例和对照组27例，两组年龄、性别比、病程、HbA1c、FPG、收缩压、舒张压、血TC、血TG、UAER、尿足细胞数量等指标比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。
1.2 标本采集与指标检测 测定所有受试者的血压、身高、体重、计算体重指数。在空腹10 h后，静息状态下抽取肘静脉血，分别送检空腹血糖（FPG）、HbA1C、胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血肌酐（SCr）；留晨尿100 ml，做足细胞计数；留取24 h尿行白蛋白排泄率测定（UAER）。血糖、胆固醇、甘油三酯、血肌酐用全自动生化仪检测。24 h尿白蛋白排泄率测定采用放免法。 1.2.1 血HbA1C采用金标法 尿足细胞计数采用免疫荧光法。主要试剂与抗体：小鼠抗人肾小球足细胞特异性标志蛋白podocalyxin单克隆抗体（PCX）；FITC标记山羊抗小鼠抗体IgG （北京中杉生物技术有限公司）。具体步骤如下：（1）取新鲜中段尿液100 ml ，以1200 r/min离心5 min。（2）取50～100 μL尿沉渣甩片，室温干燥30min。（3）丙酮4 ℃固定10 min，自然干燥，待染。（4）待染玻片以0.01 PBS冲洗。（5）置1%Triton-100中 5 min。（6）羊血清蛋白封闭，室温30 min。（7）小鼠抗人Podocalyxin单克隆抗体体积比1：20稀释，4 ℃过夜。（8）FITC荧光标记山羊抗小鼠IgG体积比1：75稀释，37 ℃孵育30 min。（9）碘化丙啶核染。（10）甘油封片。
1.2.2 荧光显微镜下观察 绿色荧光波长580 mm，蓝色荧光波长510 mm，每份标本低倍镜观察全片，高倍镜确认足细胞后摄像计算机储存.选择全片左上，左下，右上，右下和中间5个不同部位20个高倍视野，记录完整足细胞数。
1.3 研究方法 治疗组给予雷米普利口服，剂量从2.5 mg/d
开始，如无不良反应则加至5 mg/d。对照组不服用雷米普利或其他ACEI、ARB类药物，其余治疗相同。所有患者应用胰岛素强化治疗（短效人胰岛素三餐前皮下注射，空腹血糖高的患者联合中、长效胰岛素），使空腹血糖降至7 mmol/l以下，餐后血糖降至10 mmol/l以下；有高胆固醇血症者予立普妥20 mg口服，使胆固醇降至正常；血压控制不理想者可联合利尿剂、β受体阻滞剂，目标血压<130/80 mm Hg。3个月后再次测定患者的各项指标。
1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
经过雷米普利治疗3个月后，对照组和治疗组患者的尿足细胞数量较基线均有下降（P<0.05），治疗组的尿足细胞数量与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
表2 治疗组与对照组血CRP、尿足细胞数量的比较（x±s）
组别 UAER（μg/min）
足细胞数量（个/ml）
治疗前 治疗后 治疗前 治疗后
治疗组（n=29） 90.5±20.3 53.67±2.44*△ 2.9±1.8 1.5±0.7*△
对照组（n=27） 87.0±19.1 75.31±4.76* 2.7±2.4 2.3±1.9*
*与基线比较，P<0.05；△与对照组治疗后比较，P<0.05
3 讨论
在各种致病因素作用下，足细胞损伤并发生绝对数量减少是多种肾小球疾病重要的病理变化之一，如IgA肾病、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等[2-4]。足细胞数量减少的可能机制有：（1）足细胞凋亡[5]；（2）足细胞与肾小球基底膜分离[6]；（3）足细胞丧失增殖能力[6]。其中足细胞与肾小球基底膜分离后可随尿液排出，故在肾病患者的尿中可以检测到足细胞，其数量又与肾小球疾病的活动性密切相关[2-4]。本研究应用ACEI类药物雷米普利治疗DN患者，3个月后治疗组的尿中足细胞数量较基线明显下降，与对照组相比差异有统计学意义。这一结果说明，ACEI可以减轻DN患者肾脏结构的损害，维持肾小球的功能。
Nephrin是足细胞裂孔隔膜的主要组成成分之一，对维持肾小球滤过屏障的完整性起关键作用。Doublier S等[7]研究认为，DN后期nephrin表达下调伴随着蛋白尿增加，其机制可能为血管紧张素Ⅱ影响nephrin重分布和脱落，并通过糖基化终末产物来抑制nephrin 基因转录。Kienbacher C[8]的研究中DN患者nephrin表达下降可引起足细胞损伤脱落，裂孔隔膜结构和屏障功能的完整性破坏，蛋白滤过加重。Mifsud SA[9]的研究认为，ACEI或ARB减轻足细胞足突融合。所以笔者认为，ACEI能够减少DN患者尿足细胞排泄的机制可能是其抑制了AngII的生成，从而阻止nephrin表达下调，减少足细胞从基底膜脱落，维持足细胞正常结构和功能。
本研究应用雷米普利治疗DN患者，结果发现患者治疗后的尿足细胞数量较基线明显下降，与对照组比较有显著性差异，这一结果证实雷米普利可以减少DN患者尿足细胞数量。而ACEI的肾脏保护机制并不单在于其降压作用[10]，它通过降低AngII水平，阻止nephrin表达下调，减少足细胞从肾小球基底膜脱落，维持肾脏正常结构和功能。
参考文献
[1] 陈立平，周巧玲，欧阳春，等.罗格列酮对糖尿病肾病大鼠足细胞nephrin和podecin表达的影响[J].中华肾脏病杂志，2007，23（4）：263-264.
[2] Nakamura T， Ushiyama C， Suzuki S， et al. Urinary podocytes for the assessment of disease activity in lupus nephritis[J]. Am J Med Sci，2000，320（2）：112-116.
[3] Hara M， Yanagihata T， Takada T， et al. Podocalyxin on the glomerular epithelial cells is preserved well in various glomerular diseases[J]. Nephron，1994，67（1）：123-124.
[4] White K E， Bilous R W， Marshail S M， et al. Podocyte number in normotensice type 1 diabetic patients with albuminuria[J]. Diabetes，2002，51（10）：3083-3089. [5] Schiffer M， Schiffer L E， Gupta A， et al. Inhibitory Smads and TGF-beta signaling in glomerular cells[J]. J Am Soc Nephrol，2002，13（11）：2657-2666.
[6] Mundel P， Stuart J. Podocyte biology and response to injury[J].J Am Soc Nephrol， 2002，13（12）：3005-3015.
[7] Doublier S， Salvidio G， Lupia E， et al. Nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy： evidence for a distinct role for glycated albumin and angiotensin Ⅱ[J]. Diabetes，2003，52（4）：1023-1030.
[8] Kienbacher C， Wober C， Zesch H E， et al. Clinical features， classification and prognosis of migraine and tension-type headache in children and adolescents：a long-term follow-up study[J]. Cephalalgia，2006，26（7）：820-830.
[9] Mifsud S A， Allen T J， Bertram J F， et al. Podocyte foot process broadening in experimental diabetic nephropathy： amelioration with renin-angiotensin blockade[J]. Diabetologia，2001，44（7）：878-882.
[10] Ruggenenti P， Mosconi L， Vendramin G， et al. ACE inhibition improves glomerular size selectivity in patients with idiopathic membranous nephropathy and persistent nephritic syndrome[J]. Am J Kidney Dis， 2000，35：381-391.
（收稿日期：2013-01-08） （本文编辑：王宇）
【关键词】 糖尿病肾病； 足细胞； 雷米普利
Effects of Ramipril on Urinary Podocyte Number in Patients with Diabetic Nephropathy/FENG Qiu-xia， CHENG Li-jing， LU Lu， et al.//Medical Innovation of China，2013，10（15）：008-010
【Abstract】 Objective： To compare ramipril treatment of type 2 diabetes mellitus（T2DM） patients with nephropathy before and after urine enough to the change of the number of cells and to explore ramipril kidney protection mechanisms. Method： 56 patients with diabetic nephropathy（DN） microalbuminuria were randomly divided into treatment group and control group. The treatment group was given daily ramipril 5 mg， taking three consecutive months. Applications mouse anti-human monoclonal antibody podocyte-specific protein （Podocalyxin， PCX）， positively stained cells using indirect immunofluorescence to detect urinary PCX， count the number of urinary podocytes. To compare the number of urinary podocytes pre-treatment. Result： The number of urinary podocytes ramipril treatment group compared with the baseline decreased significantly（P<0.05）， compared with the control group， there was a significant difference（P<0.05）. Conclusion： Ramipril can reduce the number of urinary podocytes DN patients and protect renal function.
【Key words】 Diabetic Nephropathy； Urinary podocytes； Ramipril
First-author’s address： Dalian Municipal Central Hospital， Dalian 116011， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.15.003
糖尿病肾病的早期发现和早期治疗对于改善糖尿病患者的预后十分重要。足细胞是肾小球脏层上皮细胞，足细胞损伤与DN的蛋白尿产生及肾小球硬化有关[1]。近年研究发现，受损的足细胞可以从肾小球基底膜脱落，导致肾脏的足细胞数量减少而损害了肾脏的正常生理功能[2]。本研究通过观察血管紧张素酶抑制剂（ACEI）雷米普利对DN患者尿足细胞数量的影响，探讨雷米普利保护肾脏的机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料 按照1999年WHO诊断标准，收集本院2009年-2010年门诊和住院的56例2型糖尿病合并糖尿病肾病微量白蛋白尿期的患者（24 h尿白蛋白排泄率在20～200 μg/min之间，内生肌酐清除率>90 ml/min），除外合并糖尿病急性并发症，应激，恶性肿瘤，正在服用或半年内服用过血管紧张素酶抑制剂（ACEI） 或血管紧张素受体拮抗剂（ARB）、他汀类、噻唑脘二酮类的患者（空腹血糖<10.0 mmol/L）。所有DN患者随机分为治疗组29例和对照组27例，两组年龄、性别比、病程、HbA1c、FPG、收缩压、舒张压、血TC、血TG、UAER、尿足细胞数量等指标比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。
1.2 标本采集与指标检测 测定所有受试者的血压、身高、体重、计算体重指数。在空腹10 h后，静息状态下抽取肘静脉血，分别送检空腹血糖（FPG）、HbA1C、胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血肌酐（SCr）；留晨尿100 ml，做足细胞计数；留取24 h尿行白蛋白排泄率测定（UAER）。血糖、胆固醇、甘油三酯、血肌酐用全自动生化仪检测。24 h尿白蛋白排泄率测定采用放免法。 1.2.1 血HbA1C采用金标法 尿足细胞计数采用免疫荧光法。主要试剂与抗体：小鼠抗人肾小球足细胞特异性标志蛋白podocalyxin单克隆抗体（PCX）；FITC标记山羊抗小鼠抗体IgG （北京中杉生物技术有限公司）。具体步骤如下：（1）取新鲜中段尿液100 ml ，以1200 r/min离心5 min。（2）取50～100 μL尿沉渣甩片，室温干燥30min。（3）丙酮4 ℃固定10 min，自然干燥，待染。（4）待染玻片以0.01 PBS冲洗。（5）置1%Triton-100中 5 min。（6）羊血清蛋白封闭，室温30 min。（7）小鼠抗人Podocalyxin单克隆抗体体积比1：20稀释，4 ℃过夜。（8）FITC荧光标记山羊抗小鼠IgG体积比1：75稀释，37 ℃孵育30 min。（9）碘化丙啶核染。（10）甘油封片。
1.2.2 荧光显微镜下观察 绿色荧光波长580 mm，蓝色荧光波长510 mm，每份标本低倍镜观察全片，高倍镜确认足细胞后摄像计算机储存.选择全片左上，左下，右上，右下和中间5个不同部位20个高倍视野，记录完整足细胞数。
1.3 研究方法 治疗组给予雷米普利口服，剂量从2.5 mg/d
开始，如无不良反应则加至5 mg/d。对照组不服用雷米普利或其他ACEI、ARB类药物，其余治疗相同。所有患者应用胰岛素强化治疗（短效人胰岛素三餐前皮下注射，空腹血糖高的患者联合中、长效胰岛素），使空腹血糖降至7 mmol/l以下，餐后血糖降至10 mmol/l以下；有高胆固醇血症者予立普妥20 mg口服，使胆固醇降至正常；血压控制不理想者可联合利尿剂、β受体阻滞剂，目标血压<130/80 mm Hg。3个月后再次测定患者的各项指标。
1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
经过雷米普利治疗3个月后，对照组和治疗组患者的尿足细胞数量较基线均有下降（P<0.05），治疗组的尿足细胞数量与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
表2 治疗组与对照组血CRP、尿足细胞数量的比较（x±s）
组别 UAER（μg/min）
足细胞数量（个/ml）
治疗前 治疗后 治疗前 治疗后
治疗组（n=29） 90.5±20.3 53.67±2.44*△ 2.9±1.8 1.5±0.7*△
对照组（n=27） 87.0±19.1 75.31±4.76* 2.7±2.4 2.3±1.9*
*与基线比较，P<0.05；△与对照组治疗后比较，P<0.05
3 讨论
在各种致病因素作用下，足细胞损伤并发生绝对数量减少是多种肾小球疾病重要的病理变化之一，如IgA肾病、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等[2-4]。足细胞数量减少的可能机制有：（1）足细胞凋亡[5]；（2）足细胞与肾小球基底膜分离[6]；（3）足细胞丧失增殖能力[6]。其中足细胞与肾小球基底膜分离后可随尿液排出，故在肾病患者的尿中可以检测到足细胞，其数量又与肾小球疾病的活动性密切相关[2-4]。本研究应用ACEI类药物雷米普利治疗DN患者，3个月后治疗组的尿中足细胞数量较基线明显下降，与对照组相比差异有统计学意义。这一结果说明，ACEI可以减轻DN患者肾脏结构的损害，维持肾小球的功能。
Nephrin是足细胞裂孔隔膜的主要组成成分之一，对维持肾小球滤过屏障的完整性起关键作用。Doublier S等[7]研究认为，DN后期nephrin表达下调伴随着蛋白尿增加，其机制可能为血管紧张素Ⅱ影响nephrin重分布和脱落，并通过糖基化终末产物来抑制nephrin 基因转录。Kienbacher C[8]的研究中DN患者nephrin表达下降可引起足细胞损伤脱落，裂孔隔膜结构和屏障功能的完整性破坏，蛋白滤过加重。Mifsud SA[9]的研究认为，ACEI或ARB减轻足细胞足突融合。所以笔者认为，ACEI能够减少DN患者尿足细胞排泄的机制可能是其抑制了AngII的生成，从而阻止nephrin表达下调，减少足细胞从基底膜脱落，维持足细胞正常结构和功能。
本研究应用雷米普利治疗DN患者，结果发现患者治疗后的尿足细胞数量较基线明显下降，与对照组比较有显著性差异，这一结果证实雷米普利可以减少DN患者尿足细胞数量。而ACEI的肾脏保护机制并不单在于其降压作用[10]，它通过降低AngII水平，阻止nephrin表达下调，减少足细胞从肾小球基底膜脱落，维持肾脏正常结构和功能。
参考文献
[1] 陈立平，周巧玲，欧阳春，等.罗格列酮对糖尿病肾病大鼠足细胞nephrin和podecin表达的影响[J].中华肾脏病杂志，2007，23（4）：263-264.
[2] Nakamura T， Ushiyama C， Suzuki S， et al. Urinary podocytes for the assessment of disease activity in lupus nephritis[J]. Am J Med Sci，2000，320（2）：112-116.
[3] Hara M， Yanagihata T， Takada T， et al. Podocalyxin on the glomerular epithelial cells is preserved well in various glomerular diseases[J]. Nephron，1994，67（1）：123-124.
[4] White K E， Bilous R W， Marshail S M， et al. Podocyte number in normotensice type 1 diabetic patients with albuminuria[J]. Diabetes，2002，51（10）：3083-3089. [5] Schiffer M， Schiffer L E， Gupta A， et al. Inhibitory Smads and TGF-beta signaling in glomerular cells[J]. J Am Soc Nephrol，2002，13（11）：2657-2666.
[6] Mundel P， Stuart J. Podocyte biology and response to injury[J].J Am Soc Nephrol， 2002，13（12）：3005-3015.
[7] Doublier S， Salvidio G， Lupia E， et al. Nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy： evidence for a distinct role for glycated albumin and angiotensin Ⅱ[J]. Diabetes，2003，52（4）：1023-1030.
[8] Kienbacher C， Wober C， Zesch H E， et al. Clinical features， classification and prognosis of migraine and tension-type headache in children and adolescents：a long-term follow-up study[J]. Cephalalgia，2006，26（7）：820-830.
[9] Mifsud S A， Allen T J， Bertram J F， et al. Podocyte foot process broadening in experimental diabetic nephropathy： amelioration with renin-angiotensin blockade[J]. Diabetologia，2001，44（7）：878-882.
[10] Ruggenenti P， Mosconi L， Vendramin G， et al. ACE inhibition improves glomerular size selectivity in patients with idiopathic membranous nephropathy and persistent nephritic syndrome[J]. Am J Kidney Dis， 2000，35：381-391.
（收稿日期：2013-01-08） （本文编辑：王宇）