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摘 要 目的：探讨荧光定量聚合酶链反应检测技术与噬菌体生物扩增法在早期诊断结核性渗出性胸膜炎的临床应用价值。方法：对145例结核性渗出性胸膜炎患者行胸腔穿刺抽液术，标本送检结核分枝杆菌的荧光定量聚合酶链反应、噬菌体生物扩增法检测，并对两种方法进行比较。结果：荧光定量聚合酶链反应检测阳性率531%，高于噬菌体生物扩增法324%，P＜001有极显著差异，聚合酶链反应检测明显优于噬菌体生物扩增法。结论：结核分枝杆菌的荧光定量聚合酶链反应对早期诊断结核性渗出性胸膜炎有重要的诊断价值；噬菌体生物扩增法有一定参考价值。
关键词 聚合酶链反应 噬菌体生物扩增法 结核性渗出性胸膜炎
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.14.253
Abstract Objective:The objective of this paper is to discuss the clinical application value of fluorescence quantitative PCR and phage amplified biologically assay in the early diagnosis of tuberculous exudative pleurisy.Methods:145 tuberculous exudative pleurisy patients were operated paracentesis.The samples were detected by mycobacterium tuberculosis fluorescence quantitative PCR and phage amplified biologically assay.Then the two methods were compared.Results:The positive rate in fluorescence quantitative PCR was 53.1%,higher than 324% in phage amplified biologically assay,P＜001,with a significant difference,which shows fluorescence quantitative PCR is apparently better than phage amplified biologically assay.Conclusion:Mycobacterium tuberculosis fluorescence quantitative PCR is of great diagnostic value in the early diagnosis of tuberculous exudative pleurisy,and phage amplified biologically assay is of certain reference value.
Key Words Polymerase chain reaction PCR;Phage amplified biologically assay;Tuberculous exudative pleurisy
結核性胸膜炎是结核分枝杆菌引起的胸膜炎症病变。对结核性胸膜炎最具有诊断价值的细菌学检查阳性率很低，结核性胸腔积液中抗酸杆菌涂片阳性率仅10%～20%，培养阳性率也仅25%～50%。应用PCR检测结核杆菌DNA、噬菌体生物扩增法检测抗酸杆菌，均对结核分枝杆菌有较高的敏感性［1］。因此使用荧光定量聚合酶链反应(以下简称荧光定量PCR)及噬菌体生物扩增法(以下简称PhaB)针对病原学结核分枝杆菌的检测对早期诊断结核性渗出性胸膜炎有非常重要的意义。现将2008年1月～2011年10月采集的数据报告如下。
资料与方法
2008年1月～2011年10月收治结核性渗出性胸膜炎患者145例，男177例，女105例，年龄16～83岁，平均433±221岁。参照结核性胸膜炎的诊断标准，根据病史、临床症状、体征、胸液的改变、PPD皮试等诊断为结核性渗出性胸膜炎，并经抗结核治疗有效者。
方法：145例患者入院后在B超定位下行胸腔穿刺抽液术，胸液同时送检结核分支杆菌的荧光定量PCR、PhaB检测，根据结果比较阳性率。TB-PCR以浓度103copies/ml作为阳性定量参考。PhaB培养皿中出现大小不等的噬菌斑，且≥20个/平皿，或许多噬菌斑相互融合成透明状判定为阳性；平皿中无噬菌斑出现或噬菌斑数量≤20个/平皿为阴性。用SPSS110系统软件进行检查数值。本实验使用LightCycler荧光定量PCR仪。
结 果
145例患者中，检测结核性胸膜炎阳性率对比。荧光定量PCR阳性77例，阳性率531%；PhaB阳性47例，阳性率324%。两种方法联合检出阳性率586%。见表1。
SPSS统计软件处理(X2)：计算P＜001差异有极显著性。说明聚合酶链反应检测明显优于PhaB。
讨 论
结核性胸膜炎是由结核分枝杆菌及其代谢产物进入处于超敏状态的机体胸腔中所引起的胸膜炎症。细菌学检查是确诊结核性胸膜炎的可靠标准，但临床上通过胸液沉渣找结核分枝杆菌或结核分枝杆菌培养的阳性率很低，以及检验周期长等，造成对结核性胸膜炎早期诊断有一定的困难。
荧光定量PCR方法的基本原理为PCR扩增时，在加入1对引物的同时，加入1个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记1个报告荧光基团和1个淬灭荧光基团，由于5′端荧光基团吸收能量后，将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移，FRET)。因此，探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该法样本分析周期短，从样本采集到出示检测报告可在3小时内完成［2］。
噬菌体生物扩增法(PhaB)乃是利用分枝杆菌噬菌体D29既能感染活的结核分枝杆菌，又能感染少数几种快速生长的非结核分枝杆菌，并能在菌体内继续繁殖、裂解，大量释放D29噬菌体，迅速感染、裂解指示菌，形成噬菌斑藉以快速检测结核分枝杆菌，也可采用PhaB技术进行药敏试验。继wilson于1997年建立了PhaB技术后，该技术在临床中得到广泛应用，18～24小时内出现噬菌斑［3］，24～48小时可获得结果。
从本文统计数据可以看到，荧光定量PCR检测阳性率531%，与马玙总结较高的阳性率52%～81%相似［4］。荧光定量PCR的灵敏度高，TangYW等认为［5］，荧光定量PCR方法敏感性可至10～100fg，甚至10fg(约相当于1个细菌的DNA量)；特异性强，与牛型分枝杆菌、偶发分枝杆菌、蟾分枝杆菌、草分枝杆菌、龟分枝杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌等细菌无交叉反应。检测周期短，从样本采集到出示检测报告可在3小时内完成。但荧光定量PCR由于对标本、检验环境及操作人员的操作等要求高，存在假阳性与假阴性等问题有待解决。本文噬菌体生物扩增法阳性率则324%，与笔者所总结的胸膜活检阳性率314%近似［6］，并无明显的优越性；低于文献报道545%［7］，也明显低于本文荧光定量PCR检测阳性率531%。由于PhaB所用的噬菌体除可感染结核分枝杆菌外，还可以感染其他几种非结核分枝杆菌［8］，如偶然、金色、草、耻垢、堪萨斯、鸟-胞内、丁酸分枝杆菌等，这些细菌广泛分布于自然界及人体与外界相通的腔道，可导致检测结果假阳性；其他杀毒剂的使用也会对结果造成影响［9］。同时由地方医院转入我院的患者可能在当地曾使用喹诺酮类药物或不规则抗痨，可导致胸液中的结核分枝杆菌菌量减少，从而出现假阴性。可见影响PhaB的环节较多，该法敏感性较低，但有较高的特异度，对结核性胸膜炎还是有一定的诊断价值，但不适合做单独诊断。如果荧光定量PCR与PhaB联检，则阳性率586%，对早期诊断结核性胸膜炎有一定优势。
总而言之，对胸液行结核分支杆菌荧光定量PCR检测及PhaB检测属特异性检查，技术成熟、检验周期短。荧光定量PCR检测特异性强，技术成熟，是目前针对结核分枝杆菌检测阳性率较高的方法，对早期诊断结核性渗出性胸膜炎有重要的诊断价值；PhaB敏感性较低，对结核性胸膜炎还是有一定的参考价值。
参考文献
1 唐神结,高文.临床结核病学［M］.北京:人民卫生出版社,2011:56-65.
2 徐亚军,周子人,林琳,刘渠,刘衡川.分子信标荧光定量PCR快速检测结核杆菌方法的初步研究［J］.四川大学学报(医学版),2008,39(4):661-663.
3 刘百歌,刘鹏,郑岚,张静春.噬菌体裂解法快速检测胸水中结核分枝杆菌的研究［J］.中国实验诊断学,2009,13(4):533-534.
4 马玙,朱莉贞,潘毓萱.结核病［M］.北京:人民卫生出版社,2006:229-242.
5 Tang Y W,Procop G W,Persing D H.Molecular diagnostics of in-fectious diseases［J］.Clin Chem,1997,43(18):2021-2038.
6 吴睿彦,陈品儒,肖芃.弹簧式自动切割针胸膜活检在诊断胸腔积液病因的价值［J］.临床肺科杂志,2011,16(6):908-910.
7 林兆原,何聚莲,方琼,张宇青,邝小佳,李宇.噬菌体生物扩增法早期诊断结核性胸膜炎的临床价值［J］.临床肺科杂志,2007,12(2):157-158.
8 卜建玲,马玙.结核性胸膜炎的诊断现状与研究进展［J］.中国防痨杂志,2009,31(1):33-36.
9 徐建辉,吕志强.胸水TB-PhaB与TB-PCR和ADA测定对结核性胸腔积液诊断价值的对比研究［J］.广东医学,2010,31(23):3097-3099.
关键词 聚合酶链反应 噬菌体生物扩增法 结核性渗出性胸膜炎
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.14.253
Abstract Objective:The objective of this paper is to discuss the clinical application value of fluorescence quantitative PCR and phage amplified biologically assay in the early diagnosis of tuberculous exudative pleurisy.Methods:145 tuberculous exudative pleurisy patients were operated paracentesis.The samples were detected by mycobacterium tuberculosis fluorescence quantitative PCR and phage amplified biologically assay.Then the two methods were compared.Results:The positive rate in fluorescence quantitative PCR was 53.1%,higher than 324% in phage amplified biologically assay,P＜001,with a significant difference,which shows fluorescence quantitative PCR is apparently better than phage amplified biologically assay.Conclusion:Mycobacterium tuberculosis fluorescence quantitative PCR is of great diagnostic value in the early diagnosis of tuberculous exudative pleurisy,and phage amplified biologically assay is of certain reference value.
Key Words Polymerase chain reaction PCR;Phage amplified biologically assay;Tuberculous exudative pleurisy
結核性胸膜炎是结核分枝杆菌引起的胸膜炎症病变。对结核性胸膜炎最具有诊断价值的细菌学检查阳性率很低，结核性胸腔积液中抗酸杆菌涂片阳性率仅10%～20%，培养阳性率也仅25%～50%。应用PCR检测结核杆菌DNA、噬菌体生物扩增法检测抗酸杆菌，均对结核分枝杆菌有较高的敏感性［1］。因此使用荧光定量聚合酶链反应(以下简称荧光定量PCR)及噬菌体生物扩增法(以下简称PhaB)针对病原学结核分枝杆菌的检测对早期诊断结核性渗出性胸膜炎有非常重要的意义。现将2008年1月～2011年10月采集的数据报告如下。
资料与方法
2008年1月～2011年10月收治结核性渗出性胸膜炎患者145例，男177例，女105例，年龄16～83岁，平均433±221岁。参照结核性胸膜炎的诊断标准，根据病史、临床症状、体征、胸液的改变、PPD皮试等诊断为结核性渗出性胸膜炎，并经抗结核治疗有效者。
方法：145例患者入院后在B超定位下行胸腔穿刺抽液术，胸液同时送检结核分支杆菌的荧光定量PCR、PhaB检测，根据结果比较阳性率。TB-PCR以浓度103copies/ml作为阳性定量参考。PhaB培养皿中出现大小不等的噬菌斑，且≥20个/平皿，或许多噬菌斑相互融合成透明状判定为阳性；平皿中无噬菌斑出现或噬菌斑数量≤20个/平皿为阴性。用SPSS110系统软件进行检查数值。本实验使用LightCycler荧光定量PCR仪。
结 果
145例患者中，检测结核性胸膜炎阳性率对比。荧光定量PCR阳性77例，阳性率531%；PhaB阳性47例，阳性率324%。两种方法联合检出阳性率586%。见表1。
SPSS统计软件处理(X2)：计算P＜001差异有极显著性。说明聚合酶链反应检测明显优于PhaB。
讨 论
结核性胸膜炎是由结核分枝杆菌及其代谢产物进入处于超敏状态的机体胸腔中所引起的胸膜炎症。细菌学检查是确诊结核性胸膜炎的可靠标准，但临床上通过胸液沉渣找结核分枝杆菌或结核分枝杆菌培养的阳性率很低，以及检验周期长等，造成对结核性胸膜炎早期诊断有一定的困难。
荧光定量PCR方法的基本原理为PCR扩增时，在加入1对引物的同时，加入1个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记1个报告荧光基团和1个淬灭荧光基团，由于5′端荧光基团吸收能量后，将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移，FRET)。因此，探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该法样本分析周期短，从样本采集到出示检测报告可在3小时内完成［2］。
噬菌体生物扩增法(PhaB)乃是利用分枝杆菌噬菌体D29既能感染活的结核分枝杆菌，又能感染少数几种快速生长的非结核分枝杆菌，并能在菌体内继续繁殖、裂解，大量释放D29噬菌体，迅速感染、裂解指示菌，形成噬菌斑藉以快速检测结核分枝杆菌，也可采用PhaB技术进行药敏试验。继wilson于1997年建立了PhaB技术后，该技术在临床中得到广泛应用，18～24小时内出现噬菌斑［3］，24～48小时可获得结果。
从本文统计数据可以看到，荧光定量PCR检测阳性率531%，与马玙总结较高的阳性率52%～81%相似［4］。荧光定量PCR的灵敏度高，TangYW等认为［5］，荧光定量PCR方法敏感性可至10～100fg，甚至10fg(约相当于1个细菌的DNA量)；特异性强，与牛型分枝杆菌、偶发分枝杆菌、蟾分枝杆菌、草分枝杆菌、龟分枝杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌等细菌无交叉反应。检测周期短，从样本采集到出示检测报告可在3小时内完成。但荧光定量PCR由于对标本、检验环境及操作人员的操作等要求高，存在假阳性与假阴性等问题有待解决。本文噬菌体生物扩增法阳性率则324%，与笔者所总结的胸膜活检阳性率314%近似［6］，并无明显的优越性；低于文献报道545%［7］，也明显低于本文荧光定量PCR检测阳性率531%。由于PhaB所用的噬菌体除可感染结核分枝杆菌外，还可以感染其他几种非结核分枝杆菌［8］，如偶然、金色、草、耻垢、堪萨斯、鸟-胞内、丁酸分枝杆菌等，这些细菌广泛分布于自然界及人体与外界相通的腔道，可导致检测结果假阳性；其他杀毒剂的使用也会对结果造成影响［9］。同时由地方医院转入我院的患者可能在当地曾使用喹诺酮类药物或不规则抗痨，可导致胸液中的结核分枝杆菌菌量减少，从而出现假阴性。可见影响PhaB的环节较多，该法敏感性较低，但有较高的特异度，对结核性胸膜炎还是有一定的诊断价值，但不适合做单独诊断。如果荧光定量PCR与PhaB联检，则阳性率586%，对早期诊断结核性胸膜炎有一定优势。
总而言之，对胸液行结核分支杆菌荧光定量PCR检测及PhaB检测属特异性检查，技术成熟、检验周期短。荧光定量PCR检测特异性强，技术成熟，是目前针对结核分枝杆菌检测阳性率较高的方法，对早期诊断结核性渗出性胸膜炎有重要的诊断价值；PhaB敏感性较低，对结核性胸膜炎还是有一定的参考价值。
参考文献
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2 徐亚军,周子人,林琳,刘渠,刘衡川.分子信标荧光定量PCR快速检测结核杆菌方法的初步研究［J］.四川大学学报(医学版),2008,39(4):661-663.
3 刘百歌,刘鹏,郑岚,张静春.噬菌体裂解法快速检测胸水中结核分枝杆菌的研究［J］.中国实验诊断学,2009,13(4):533-534.
4 马玙,朱莉贞,潘毓萱.结核病［M］.北京:人民卫生出版社,2006:229-242.
5 Tang Y W,Procop G W,Persing D H.Molecular diagnostics of in-fectious diseases［J］.Clin Chem,1997,43(18):2021-2038.
6 吴睿彦,陈品儒,肖芃.弹簧式自动切割针胸膜活检在诊断胸腔积液病因的价值［J］.临床肺科杂志,2011,16(6):908-910.
7 林兆原,何聚莲,方琼,张宇青,邝小佳,李宇.噬菌体生物扩增法早期诊断结核性胸膜炎的临床价值［J］.临床肺科杂志,2007,12(2):157-158.
8 卜建玲,马玙.结核性胸膜炎的诊断现状与研究进展［J］.中国防痨杂志,2009,31(1):33-36.
9 徐建辉,吕志强.胸水TB-PhaB与TB-PCR和ADA测定对结核性胸腔积液诊断价值的对比研究［J］.广东医学,2010,31(23):3097-3099.