【摘 要】目的：探索维甲酸诱导蛋白14（Retinoic Acid Induced 14， RAI14）在胃癌组织中的表达水平，并分析其表达水平的临床意义。方法：通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测2019年1月至2019年3月期间42例胃癌患者的新鲜胃癌组织及其对应的癌旁正常组织标本RAI14 mRNA的相对表达量。另通过免疫组织化学法检测2011年3月至2013年5月期间于我院胃肠外科病区住院行手术治疗的122例患者的胃癌组织及其对应癌旁正常组织标本RAI14蛋白的表达。统计RAI14在胃癌组织中的表达水平，分析其及与患者临床病理特征的关系。通过单因素、多因素分析，分析胃癌组织中的RAI14表达水平与患者预后的相关性。结果：胃癌组织中RAI14 mRNA的表达水平明显高于其癌旁正常组织（P<0.05）。免疫组织化学法结果显示RAI14在胃癌组织中的表达阳性率高于癌旁正常组织（P<0.05）。RAI14阴性组的生存率高于阳性组（P<0.05）。肿瘤的分化程度、直径、浸润深度、淋巴结转移数量与胃癌组织RAI14蛋白的过度表达有关（P<0.05）。单因素分析显示肿瘤RAI14表达异常、肿瘤直径、浸润深度、分化程度以及淋巴结转移数目与胃癌患者预后存在一定的相关性（P<0.05），Cox多因素分析可见RAI14表达异常、浸润深度以及淋巴结转移数是影响胃癌患者预后的独立因素（P<0.05）。结论：胃癌组织中存在明显的RAI14异常表达，RAI14过表达与胃癌的发生、发展存在一定的相关性，也有助于判断胃癌患者的预后，因此RAI14有望成为一项新型的胃癌肿瘤标记物。
【关键词】RAI14;胃癌;qRT-PCR;免疫组织化学法;预后
【中图分类号】R197 【文献标识码】A 【文章編号】1004-7484（2019）07-0078-03
Expression of RAI14 in gastric cancer tissues and its clinical significance★
LIU Chengye， HE Xinyang*， JIN Rong， ZHAO Yajun， WANG Xiaoqiu， TIAN Rui
（Department of general surgery， provincial hospital affiliated to anhui medical university， Hefei， Anhui， 230001， China）
【Abstract】Objective： To explore the expression of 14 （Retinoic Acid Induced 14， RAI14） in gastric carcinoma and to analyze its clinical significance. Methods： Real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the relative expression of RAI14 mRNA in 42 fresh gastric cancer tissues and their corresponding normal adjacent tissues from January 2019 to March 2019. The expression of RAI14 protein in gastric cancer tissues and corresponding normal tissues of 122 patients hospitalized in gastrointestinal surgery ward of our hospital from March 2011 to May 2013 was detected by immunohistochemical method. The expression level of RAI14 in gastric cancer was analyzed and its relationship with clinicopathological features was analyzed. The correlation between RAI14 expression and prognosis in gastric cancer was analyzed by univariate and multivariate analysis. Results： The expression level of RAI14 mRNA in gastric cancer tissues was significantly higher than that in paracancerous normal tissues （P < 0.05）. The positive rate of RAI14 expression in gastric cancer tissues was higher than that in adjacent normal tissues （P < 0.05）.The survival rate of RAI14 negative group was higher than that of positive group（P < 0.05）.The degree of differentiation， diameter， depth of invasion and the number of lymph node metastasis were related to the overexpression of RAI14 protein in gastric cancer（P<0.05）.Univariate analysis showed that abnormal expression of RAI14， tumor diameter， depth of invasion， degree of differentiation and number of lymph node metastasis were correlated with prognosis of patients with gastric cancer （P < 0.05）. Cox multivariate analysis showed that abnormal expression of RAI14， number of lymph node metastasis and depth of invasion were independent factors affecting the prognosis of patients with gastric cancer. Conclusion：There is obvious abnormal expression of RAI14 in gastric cancer. There is a certain correlation between the overexpression of RAI14 and the occurrence and development of gastric cancer， and it is also helpful to judge the prognosis of patients with gastric cancer. RAI14 is expected to become a new type of gastric cancer tumor marker.
【Key words】 Retinoic acid induced 14 （RAI14）; Gastric cancer; RT-PCR; Immunohistochemical method; Prognosis
前言
胃癌是世界上最常见的高发病率肿瘤之一，其致死率在所有癌症中也高居第三位[1-5]。与此同时，相关统计数据显示：在我国，胃癌发病率和死亡率均高居第二位[6]。因为早期胃癌大多无症状或症状轻微，所以当临床症状明显时大部分胃癌患者已处于进展期，因此失去了最好的治疗机会，而且这些患者的总体预后很差[7-9]。目前胃癌的主要治疗手段是以手术为中心的多学科综合治疗[10]，但因其易复发，远处转移和产生化疗耐药性，胃癌的总的5年生存率仅为35.9%左右[11]，因此找到一个可以用于胃癌诊断和治疗，并且可以评估患者预后的标志物，成为临床研究的重点。
维甲酸诱导蛋白14（Retinoic Acid Induced 14，RAI14）是通过对视黄酸诱导人类视网膜色素上皮细胞（RPE）细胞系ARPE-19发现并克隆对新基因[12]。最近的研究表明，维甲酸诱导蛋白14可能在化疗耐药性，癌细胞增殖和某些恶性肿瘤侵袭过程中发挥关键作用，然而，有关RAI14在胃癌中的表達水平、临床预后意义以及其与肿瘤血管生成的潜在机制尚未得到充分研究。本研究检测了胃癌组织和对应癌旁正常组织中RAI14的表达，分析了RAI14在胃癌组织中的表达情况，并探讨其与胃癌患者的临床病理特征、参数以及生存率等资料之间的相关性。
1 材料与方法
1.1 一般资料
收集2019年1月至2019年3月间在中国科学技术大学附属第一医院胃肠外科病区手术治疗的42例胃癌患者的癌组织及对应的癌旁正常组织（距肿块边缘距离>5cm）标本，手术切除病灶后，迅速将新鲜病灶组织置于无菌试管中，-80℃保存备用，用于qRT-PCR检测;另选取2011年3月至2013年5月在中国科学技术大学附属第一医院122例行手术治疗的患者的胃癌组织和癌旁正常组织标本，其中男性83例，女性39例。年龄为29～81岁，中位年龄61岁。标本经固定、包埋、切片后进行免疫组织化学法检测。本研究所有病例均为原发性胃癌，不包括家族肿瘤的遗传史，术前未进行放疗和化疗。术后病理证实为胃腺癌。
1.2 主要试剂与仪器
PCR试剂与仪器：Life Technogies公司提供的TRIzolRNA 抽提试剂盒，上海联迈生物提供的pcr引物，广州东盛生物科技提供的逆转录试剂盒，罗氏公司的LightCycler 96荧光定量PCR仪及其配套的荧光定量PCR试剂盒。
免疫组织化学试剂与仪器：艾博抗（上海）贸易提供的一抗体兔抗人Rai14，福州迈新生物提供的新型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物、基因科技（上海）提供的DAB显色盒及免疫组织化学染色试剂盒。
1.3 方法
1.3.1 qRT-PCR检测 按照产品使用说明，将得到癌旁正常组织和癌组织分别称重，切碎，在液氮中研磨，并加以TRIzol试剂进行裂解处理。加入氯仿，剧烈振荡，放置室温下。 4℃条件下，以 12000rpm转速离心，收集上清（约500ul），并加入异丙醇进行混匀。冰上孵育。再次离心后弃去上清液。 加入预冷的 75℅乙醇。4℃ 12000rpm离心，弃上清。 重复步骤上述步骤，RNA沉淀在室温下干燥，提取出总RNA，并保存在-80℃条件下备用。使用逆转录试剂盒合成cDNA第一链，以此为荧光定量模板，用荧光定量PCR试剂盒进行检测PCR。RAI14基因的特异引物：顺向5‘端引物5‘- GGAAGCCAGTGATGAAGCTG -3‘;反向3‘端引物5‘- TCAGCCTGGGCTTCTTTGTA -3‘;长度111 bp;基因的定量分析使用β-actin作为对照，顺向5‘端引物5‘- CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3‘;反向3‘端引物5‘- GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3‘;长度96 bp。RAI14 mRNA的相对表达量运用2 -ΔΔCt 法进行计算。
1.3.2 免疫组织化学染色及其评价 将组织切片现经二甲苯脱蜡后 再予以浓度梯度酒精置换后，然后选取磷酸缓冲盐溶液（PBS）进行冲洗。常温下用3%H202 进行孵育10 min左右，再选取95°C柠檬酸缓冲液（pH6.0）进行冲洗以修复抗原，继续在室温下加入非免疫性山羊血清孵育15min左右，以达到阻断非特异性免疫反应的作用。将组织表面滴加（将稀释成1：100的一抗兔抗人RAI14低于切面上，并在4℃条件下孵育过夜。第二天复温0.5h，PBS缓冲液冲洗3次，加入二抗，孵育0.5h后滴加新鲜的DAB显色剂进行显色，随后用苏木精复染，流水冲洗，脱水干燥并封固，最后在显微镜下观察结果。
1.4 结果判定 光镜下观察整个切片，每例切片随机选择5个高倍镜视野（×200），根据切片阳性染色强度分级及细胞染色比例分级的总评分进行判定结果。其中无着色、淡黄色、棕黄色以及棕褐色的阳性细胞染色强度分别为0、1、2、3分;阳性细胞染色比例占比0%、不足20%、20～50%、高于50%的评分分别为0、1、2、3分。总分≤2分为阴性，即低表达）;总分>2分视为阳性，即高表达。
1.5 随访 对患者进行随访，随访的方式包括门诊或电话等，随访截止时间2018年12月。
1.6 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行统计学分析。计量资料以t检验;计数资料通过χ2检验分析;RAI14的过表达与胃癌患者总生存期（OS）的相关性应用Kaplan-Meier生存曲线进行分析;并对胃癌患者预后的相关因素进行单因素分析及Cox回归多因素分析。P<0.05即差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RAI14 mRNA在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达
图1可见胃癌组织中RAI14 mRNA的表达水平为（8.48±7.46）显著高于其癌旁正常组织的（2.52±3.19），差异有统计学意义（t=4.976，P<0.05）。
2.2 RAI14蛋白在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达情况
表1，图2显示RAI14在胃癌组织中的表达阳性率为72.2%（88/122），高于癌旁正常组织的30.4%（37/122），差异有统计学意义（χ2=42.665，P<0.05）。
2.3 RAI14蛋白在胃癌组织中的表达水平与临床病理特征的关系
表2可见，肿瘤的分化程度、直径、浸润深度、淋巴结转移数量与胃癌组织RAI14蛋白的过度表达有关（P<0.05）。而年龄、性别差异与RAI14蛋白的过度表达无关（P>0.05）。
2.4 RAI14蛋白在胃癌组织的表达水平与胃癌患者预后的关系
Kaplan-Meier生存曲线分析可见RAI14阴性组的生存率高于阳性组（χ2=10.939，P<0.05）。表3的单因素分析显示肿瘤RAI14表达异常、肿瘤直径、浸润深度、分化程度以及淋巴结转移数目与胃癌患者预后存在一定的相关性（P<0.05），表4的Cox多因素分析可见RAI14表达异常、浸润深度以及淋巴结转移数是影响胃癌患者预后的独立因素（P<0.05）。
3 讨论
胃癌是一种全球常见的实体恶性肿瘤，其预后差，容易复发和发生转移，严重影响人类健康[12]。RAI14基因是由Kutty等于2001年发现的[13]，该基因定位于5p13.2～13.3，由于不同的剪切机制，其转录产物有5kb和3kb左右两种形式，在人和小鼠中具有很高的同源性，达到91%。在人类中，其cDNA全长4925bp，编码980氨基酸，蛋白大小约110kDa。值得注意的是，RAI14蛋白结构上有两个重要特点：一是在蛋白的C端有一个大的螺旋-螺旋结构域，覆盖了整个蛋白质的60%，这样的结构特点成为蛋白自身聚合或与其它蛋白相互作用的基础;第二是在N端有6个重复的锚蛋白序列（每个重复序列包含33个氨基酸），它们是蛋白质相互结合的场所。同时Kutty应用Nothern blotting和原位杂交进一步发现，该基因在多种肿瘤细胞（腺性结肠癌SW480、肺癌细胞A549、淋巴瘤K-562、Hela cell s3等）也有高表达，这一结果提示RAI14基因可能在细胞增殖以及肿瘤的发生中承担着重要角色[13]。
最近的研究表明，RAI14可能在化疗耐药性、癌细胞增殖和某些恶性肿瘤侵袭过程中发挥关键作用。例如，Hsu等进行了全基因组分析以鉴定与抗肿瘤药物（包括紫杉醇、多西紫杉醇、厄洛替尼、依维莫司和达沙替尼）显著相关的一组8个基因，（EGFR、ITGA3、MYLK、RAI14、AHNAK、GLS、IL32和NNMT）[14]。Hawkins等发现NR2F2可以通过调节NEK2、RAI14参与卵巢癌细胞周期相关的多种基因的表达[15]。Paez等已经证明RAI14参与前列腺癌细胞骨架的调节[16]。此外，Zhou等结合生物信息学和实验验证的方法鉴定出RAI14是胃癌中与药物反应相关的基因之一[17]。然而，在肺腺癌中发现不一致的现象，Yuan等发现RAI14肺癌组织及细胞系A549高表达，但高表达RAI14显著抑制了肺腺癌细胞增殖[18]。
胃癌具有较强的富血管性，其生长和转移依赖于新生血管的生成[19-21]。理论上，血管靶向治疗是一种有效的抗癌途径。然而，临床实践表明抗血管生成药物对晚期胃癌患者生存期的影响十分有限，目前被临床证实有效的小分子靶向药仅有阿帕替尼一种[22-25]。因此，找寻新的抗血管生成治疗靶点也一直是胃癌研究领域的重点方向之一。
本研究通过胃癌组织和癌旁正常组织中RAI14 mRNA表达和RAI14蛋白表达情况进行对比，发现癌组织中RAI14 mRNA的表达和RAI14蛋白表达均要显著高于癌旁正常组织。进一步分析显示肿瘤的分化程度、直径、浸润深度、淋巴结转移数量与胃癌组织RAI14蛋白的过度表达有关（P<0.05）。而RAI14阴性组的生存率高于阳性组（P<0.05）。单因素和Cox多因素分析显示RAI14表达异常、浸润深度以及淋巴结转移数是影响胃癌患者预后的独立因素（P<0.05）。结果提示胃癌组织中存在明显的RAI14异常表达，这种异常表达与胃癌的发生、发展存在一定的相关性，且对于判断胃癌患者的预后也能提供一定的参考价值。
综上所述， 胃癌组织中存在明显的RAI14异常表达，RAI14過表达与胃癌的发生、发展存在一定的相关性，也有助于判断胃癌患者的预后，因此RAI14有望成为一项新型的胃癌肿瘤标记物。基于上述科学理论，接下来我们将围绕RAI14参与调控胃癌血管生成作用及机制进一步探索与研究。
参考文献（References）
[1]Siegel RL， Miller KD， Jemal A： Cancer Statistics， 2017. Cancer J Clin， 2017;67： 7–30
[2]Sitarz R， Skierucha M， Mielko J et al. Gastric cancer： Epidemiology， preven-tion， classification， and treatment. [J] Cancer Manag Res， 2018; 10： 239–48. Doi： 10. 2147/CMAR.S149619
[3]Song Z， Wu Y， Yang J et al. Progress in the treatment of advanced gastric cancer.[J] Tumour Biol， 2017; 39： 1010428317714626. Doi： 10. 1177/1010428317714626
[4]Chon SH， Berlth F， Plum PS et al. Gastric cancer treatment in the world： Germany.[J] Transl Gastroenterol Hepatol， 2017; 2： 53. Doi： 10. 21037/tgh. 2017. 05. 07
[5]Lee HS， Kim WH， Kwak Y et al. Molecular testing for gastrointestinal cancer.[J] Pathol Transl Med， 2017; 51： 103–21. Doi： 10. 4132/jptm. 2017. 01. 24
[6]Chen W ， Zheng R ， Baade P D ， et al. Cancer Statistics in China， 2015[J]. CA A Cancer Journal for Clinicians， 2016， 66（2）：115-132. Doi： 10. 3322/caac. 21338
[7]Li B， Liu HY， Guo SH et al. Detection of microsatellite instability in gastric cancer and dysplasia tissues.[J] Int J Clin Exp Med， 2015; 8： 21442–47. 無doi
[8]Sun Z， Wang Q， Yu X et al. Risk factors associated with splenic hilar lymphnode metastasis in patients with advanced gastric cancer in northwest China.[J] Int J Clin Exp Med， 2015; 8： 21358–64. 无doi
[9]Wu H， Wang W， Tong S et al. Nucleostemin regulates proliferation and migration of gastric cancer and correlates with its malignancy [J] .Int J Clin Exp Med， 2015; 8： 17634–43. 无doi
[10]Macdonald JS， Smalley SR， Benedetti J， Hun dahl SA， Estes NC， Stemmermann GN， Haller DG， Ajani JA， Gunderson LL， Jessup JM and Martenson JA. Chemoradiotherapy after sur gery compared with surgery alone for adeno carcinoma of the stomach or gastroesophage al junction. N Engl J Med 2001; 345： 725-730. 无doi
[11]De Angelis R， Sant M， Coleman MP， et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age： results of EURO CARE--5-a population-based study. Lancet On col 2014; 15： 23-34. Doi： 10. 1016/S1470-2045（13）70546-1
[12]Siegel RL， Miller KD， Jemal A. Cancer Statistics， 2017. 2017; 67（1）： 7-30.
[13]Kutty RK， Kutty G， Samuel W et al. Molecular characterization and developmental expression of NORPEG， a novel gene induced by retinoic acid.J Biol Chem， 2001; 276： 2831–40. Dio： 10. 1074/jbc. m007421200
[14]Hsu YC， Chen HY， Yuan S et al. Genome-wide analysis of three-way interplay among gene expression， cancer cell invasion and anti-cancer compound sensitivity.[J] BMC Med， 2013; 11： 106. Doi： 10.1186/1741-7015-11-106
[15]Hawkins SM， Loomans HA， Wan YW et al. Expression and functional pathway analysis of nuclear receptor NR2F2 in ovarian cancer[J]. The Journal of clinical endocrinology and metabolism， 2013; 98（7）： E1152–62. Doi： 10. 1210/jc. 2013-1081
[16]Paez AV， Pallavicini C， Schuster F et al. Heme oxygenase-1 in the forefront of a multi-molecular network that governs cell-cell contacts and filopodia induced zippering in prostate cancer[J]. Cell Death Dis， 2016; 7（12）： e2570. Doi： 10. 1038/cddis. 2016. 420
[17]Zhou J， Yong WP， Yap CS et al. An integrative approach identified genes associated with drug response in gastric cancer[J]. Carcinogenesis， 2015; 36（4）：441–51. Doi： 10. 1093/carcin/bgv014
[18]Yuan C， Hu H， Kuang M et al. Super enhancer associated RAI14 is a new potential biomarker in lung adenocarcinoma. Oncotarget， 2017; 8（62）： 105251–61. Doi： 10. 18632/oncotarget. 22165
[19]Nienhüser H， Schmidt T. Angiogenesis and Anti-Angiogenic Therapy in Gastric Cancer. Int J Mol Sci. 2017; 19（1）. pii： E43. Doi： 10.3390/ijms19010043
[20]Pinto MP， Owen GI， Retamal I， et al. Angiogenesis inhibitors in early development for gastric cancer[J]. Expert Opin Investig Drugs. 2017; 26（9）： 1007-1017. Doi： 10. 1080/13543784. 2017. 1361926
[21]Jin Z， Yoon HH. Antiangiogenic Therapy in Gastroesophageal Cancer [J] .Hematol Oncol Clin North Am. 2017; 31（3）： 499-510. Doi： 10. 1016/j. hoc. 2017. 01. 008
[22]Roviello G， Ravelli A， Fiaschi AI， et al. Apatinib for the treatment of gastric cancer[J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2016; 10（8）： 887-892.
[23]Brower V. Apatinib in treatment of refractory gastric cancer[J]. Lancet Oncol. 2016; 17（4）： e137. Doi： 10. 1016/S1470-2045（16）00138-8
[24]Li J， Qin S， Xu J， et al. Randomized， Double-Blind， Placebo-Controlled Phase III Trial of Apatinib in Patients With Chemotherapy-Refractory Advanced or Metastatic Adenocarcinoma of the Stomach or Gastroesophageal Junction[J]. J Clin Oncol. 2016; 34（13）： 1448-1454. Doi： 10. 1200/JCO. 2015. 63. 5995
[25]Li J， Qin S， Xu J， et al. Apatinib for chemotherapy-refractory advanced metastatic gastric cancer： results from a randomized， placebo-controlled， parallel-arm， phase II trial[J]. Journal of clinical oncology ： official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2013; 31（26）： 3219-3225. Doi： 10. 1200/JCO. 2013. 48. 8585
項目基金：
安徽省自然科学基金项目（项目编号：1908085MH282）;CSCO-恒瑞肿瘤研究基金资助项目（项目编号：Y-HR2017-021）