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【摘要】目的研究凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因多态性的检测方法，了解该基因突变在中国汉族人群中的分布频率。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术结合Hin6I酶切分析、琼脂糖凝胶电泳确定基因型，对106例汉族脑梗死患者及120例正常人进行检测，分析凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因多态性特点。结果脑梗死组Val34Leu杂合突变频率为3.8%，正常对照组为1.7%，两组间基因型频率分布无统计学差异(P均>0.05)。结论脑梗死患者凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因突变频率与正常人群无显著性差异，建立的PCRRFLP方法适用于凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因突变的检测。
【关键词】聚合酶链反应；凝血因子ⅩⅢ；基因突变
文章编号：1003-1383(2006)03-0237-03
中图分类号：R 446.62文献标识码：A
Analysis of coagulation factor ⅩⅢ Val34leu gene polymorphism in patients with cerebral infarction by PCRRFLP method
XIE Chunying, PAN Chunyan, TU Chunqing, WU Jianzeng, YE Guoqiang, DENG Chunyan.
(Department of laboratory science, Bao'an People's Hospital, Shenzhen, 518101, China)
【Abstract】ObjectiveTo establish a method for coagulation factor ⅩⅢ (FⅩⅢ) Val34leu gene polymorphism and study the frequency of genetic mutation in the Chinese Han population.
MethodsThe Val34leu genewas detected by combining the polymerase chain reaction (PCR) with Hin6I enzyme analysis and agarose gel electrophoresis in 106 patients with cerebral infarction and 120 normal controls. The characteristic of FⅩⅢ Val34Leu polymorphism was studied.ResultsThe Val34Leu heterozygote frequency in cerebral in fraction group and normal group was 3.8% and 1.7% respectively. The genetype frequency between the two groups had no difference. The gene frequency of Leu34 allele was 0.8%, which was lower than that of white people (27%).Con
clusionGene mutation of Val34Leu polymorphism has some differences in races or region. The polymerase chain reactionrestriction of fragment length polymorphism (PCRRFLP) methods is suitable for detection of FⅩⅢ Val34Leu gene mutation.
【Key words】polymerase chain reactionrestriction; coagulation factorⅩⅢ; gene polymorphism
凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)又称纤维蛋白稳定因子，是一种转谷氨酰胺酶原，在正常止血和伤口愈合过程中起重要作用，激活后的血浆FⅩⅢ是转谷氨酰胺酶，其活性范围大，可能与FⅩⅢ基因多态性有关，而FⅩⅢ基因多态性可能是动、静脉血栓形成的一个保护性遗传因素[1，2]，近年来引起了国内外科学家们的密切关注，国内学者鲜有报道。为了解我国汉族人群FⅩⅢVal34Leu基因变异频度，我们建立了PCRRFLP检测方法，对106例脑梗死患者和120例正常汉族人群血标本进行检测，现将结果报道如下。
材料与方法
1.材料
(1)标本来源106例汉族脑梗死患者为深圳市宝安区人民医院神经内科住院患者，男性58例，女性48例，年龄35~87岁，符合1996年全国脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经CT或MRI证实。正常对照120例来自本院汉族健康体检者，无缺血性心、脑血管病史及静脉血栓史。于清晨空腹抽取病例及对照组外周血2 ml，EDTA抗凝，冻存于-20℃待测。
(2)试剂分离纯化试剂盒(Puregene DNA isolarion Kits)为Gentra公司产品；Taq DNA聚合酶、dNTPmix、Hin6I限制性内切酶及分子量标准PUC19DNA/MspI为MBI公司产品；EZ Spin column PCR Product Purification Kit为Sangon公司产品。
(3)引物设计和合成根据Balogh等[3]设计的引物，上游序列5’ACT TCC AGG ACC GCC TTT GGA GGC3’，下游序列5’GT TGA CGC CCC GGG GCA CCG-3’，下游序列3’端下划线的G为一错配碱基(原为A)，可以在正常序列(GCGC)中引入一个Hin6I酶切位点，而在变异序列(GCTC)中无Hin6I酶切位点。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
(4)仪器PE9600型扩增仪系美国PE公司产品；台式低温高速离心机为美国Sigma产品，KODAK1D型凝胶成像系统购自美国IEC公司。
2.方法
(1)基因组DNA抽提取300 μl全血加入900 μl红细胞裂解液，充分混合，室温下孵育1分钟，在相对离心力(RCF)13000~16000 g下离心20秒钟，留下可见的白细胞层，再加入300 μl细胞裂解液混匀，然后经蛋白质沉淀、DNA沉淀、溶解，快速分离DNA。
(2)聚合酶链反应反应体系及条件参照文献[3]并略加改进。总体积为25 μl，含200 μmol/l dNTP，上、下游引物各10 pmol, 2.0 mmol/L MgCl2, 0.4 UTaq酶和0.5 μgDNA模板。反应条件为95℃3 min；循环：94℃1 mim，55℃1 min，72℃1 min，共35个循环；延伸72℃10 min。PCR扩增产物为114 bpDNA片段。
(3)限制性内切酶分析产物经EZ Spin column PCR Product Purification Kit纯化，取纯化的产物10 μl，用限制性内切酶Hin 6 I10U,37℃消化过夜，反应体积20 μl，取5 μl消化后产物在30 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察结果。
(4)基因型鉴定PCR扩增产物114 bp片段中存在一个Hin6酶切位点，可将片段切成94 bp、20 bp两个片段，当FⅩⅢa亚单位2号外显子上的34号密码子发生GT突变，导致其编码的缬氨酸被亮氨酸替代时，则消除了Hin6酶切点，因此，根据琼脂糖凝胶电泳所见区带的位置，以PUC19DNA/MspI/Maker作为标准分子量，从而鉴定基因型为突变纯合子或Val34Leu杂合子或Val34野生型。
3.统计学处理
采用SPSS10.0 for windows统计软件对组间基因型频率的差异进行χ2检验。
结果
1.基因型电泳图谱PCR产物经Hin6I酶切后琼脂糖凝胶电泳只可见94 bp一条区带，则受检个体为Val34野生型(20 bp片段分子量较小而难以显示)，如可见114 bp和94 bp两条区带者为Val34Leu杂合子，只可见114 bp条带者为Leu34突变纯合子，见图1。
1，2，3，5，6，7：Val/Val；8：Val/Leu杂合子；
4：酶切前PCR产物；M: PUC19DNA/MspI/Maker图1FⅩⅢVal34Leu基因型电泳图
2.两组FⅩⅢVal34Leu基因型分布频率比较对照组FⅩⅢVal34Leu杂合突变频率为1.7%，Leu34等位基因频率为0.8%，脑梗死组的Val/Leu杂合突变率为3.8%，对照组为1.7%，两组均未见纯合突变型。两组基因型及等位基因分布频率比较均无统计学差异(P>0.05)。见表1。
讨论
FⅩⅢ是由2 a亚单位和2 b亚单位组成的四聚体，分子量为320 kb,活性部位在a亚单位，对FⅩⅢ亚单位缺失者的基因研究中发现了四种突变，其中编码FⅩⅢa亚单位基因的第2外显子163位有GT点突变，使a亚单位34位的缬氨酸变成亮氨酸(FⅩⅢVal34Leu)，故人群中出现三种基因型(多态性)：野生型Val/Val，杂合突变型Val/Leu，纯合突变型Leu/Leu。多数研究认为，Val/Leu突变可能会防止病人的血栓形成，但可能是原发性脑出血的一种危险因素[1，2，4]。也有报道认为Val34Leu突变与血栓形成没有明显关系，而同源Leu34等位基因才具有保护性作用，其原因在于这种等位基因可以增加血液中FⅩⅢ的浓度，从而加强了纤维蛋白交联的形成。
不同种族、不同国家FⅩⅢVal34Leu多态性基因频率的差异性很大，这可能是造成血栓性疾病在不同地区发生率不同的原因之一。据国外文献报道[5]，澳洲人基因频率Val34为73%，Leu34为27%，德国人Val34为89%，Leu34为11%，日本人Val34与Leu34的频率分别为99%和1%。我们研究106例脑梗死患者和120例正常人的FⅩⅢVal34Leu基因频率，结果显示，正常汉族人群中Leu34等位基因频率为0.8%，明显低于白种人，与日本人群相似[6]，与国内谢汝萍等[4]的研究结果(0.7%)基本一致，表明了黄种人(汉族)基因频率比白种人低，FⅩⅢVal34Leu突变频率在脑梗死与正常人组之间的差异无显著性，提示FⅩⅢVal34Leu可能并非汉族人群血栓性疾病的保护性遗传因素[7，8]，采用PCRRFLP法检测凝血因子ⅩⅢVal34Leu突变，对研究FⅩⅢ多态性与心脑血管性疾病的关系有一定意义。
参考文献
［1］Kohler HP,Stickland MH,OsseiGerning N,et al.Association of a common polymorphism in the factor ⅩⅢ gene with myocardial infarction［J］.Thromb Haemost，1998，79:8-13.
［2］Elbaz A,Poirier O,Canaple S,et al.The association between the Val34Leu polymorphism in the factor ⅩⅢ gene and brain infarction［J］.Blood，2000，95:586-591.
［3］Balogh I,Szoke G,Karpati L,et al. Val34Leu polymorphism of plasma factor ⅩⅢ:biochemistry and epidemiology in familial thrombophilia［J］.Blood，2000，96:2479-2486.
［4］谢汝萍，杨志杰，于敏，等.凝血因子ⅩⅢ基因Val34Leu突变与脑出血神经功能的相关性研究［J］.现代康复，2001，5(2)：92-93.
［5］Kangsadalampai S,Board PG.The Val34Leu polymorphism in the A subunit of coagulation factor ⅩⅢ contributes to the large normal range in activity and demonstratrates that the activation peptide plays a role in catalytic activity［J］.Blood, 1998, 92(8): 2766-2770.
［6］Cho KH, Kim BC, Kim MK, et al. No association of factor ⅩⅢVal34Leu polymorphism with primary intracerebral hemorrhage and healthy controls in Korean population［J］.J Korean Med sci，2002,17(2):249-253.
［7］涂传清，吴建增，谢春英，等.深圳地区汉族人凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因多态性研究［J］.广东医学院学报，2004，22(6)：566-567.
［8］涂传清，吴建增，谢春英，等.汉族人群凝血因子ⅩⅢVal34Leu多态性与动静脉血栓性疾病的关系［J］.中国临床康复，2005，9(1)：70-71.
(收稿日期：2006-04-10修回日期：2006-06-05)
(编辑：梁明佩英文审校：钟京梓)
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
【关键词】聚合酶链反应；凝血因子ⅩⅢ；基因突变
文章编号：1003-1383(2006)03-0237-03
中图分类号：R 446.62文献标识码：A
Analysis of coagulation factor ⅩⅢ Val34leu gene polymorphism in patients with cerebral infarction by PCRRFLP method
XIE Chunying, PAN Chunyan, TU Chunqing, WU Jianzeng, YE Guoqiang, DENG Chunyan.
(Department of laboratory science, Bao'an People's Hospital, Shenzhen, 518101, China)
【Abstract】ObjectiveTo establish a method for coagulation factor ⅩⅢ (FⅩⅢ) Val34leu gene polymorphism and study the frequency of genetic mutation in the Chinese Han population.
MethodsThe Val34leu genewas detected by combining the polymerase chain reaction (PCR) with Hin6I enzyme analysis and agarose gel electrophoresis in 106 patients with cerebral infarction and 120 normal controls. The characteristic of FⅩⅢ Val34Leu polymorphism was studied.ResultsThe Val34Leu heterozygote frequency in cerebral in fraction group and normal group was 3.8% and 1.7% respectively. The genetype frequency between the two groups had no difference. The gene frequency of Leu34 allele was 0.8%, which was lower than that of white people (27%).Con
clusionGene mutation of Val34Leu polymorphism has some differences in races or region. The polymerase chain reactionrestriction of fragment length polymorphism (PCRRFLP) methods is suitable for detection of FⅩⅢ Val34Leu gene mutation.
【Key words】polymerase chain reactionrestriction; coagulation factorⅩⅢ; gene polymorphism
凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)又称纤维蛋白稳定因子，是一种转谷氨酰胺酶原，在正常止血和伤口愈合过程中起重要作用，激活后的血浆FⅩⅢ是转谷氨酰胺酶，其活性范围大，可能与FⅩⅢ基因多态性有关，而FⅩⅢ基因多态性可能是动、静脉血栓形成的一个保护性遗传因素[1，2]，近年来引起了国内外科学家们的密切关注，国内学者鲜有报道。为了解我国汉族人群FⅩⅢVal34Leu基因变异频度，我们建立了PCRRFLP检测方法，对106例脑梗死患者和120例正常汉族人群血标本进行检测，现将结果报道如下。
材料与方法
1.材料
(1)标本来源106例汉族脑梗死患者为深圳市宝安区人民医院神经内科住院患者，男性58例，女性48例，年龄35~87岁，符合1996年全国脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经CT或MRI证实。正常对照120例来自本院汉族健康体检者，无缺血性心、脑血管病史及静脉血栓史。于清晨空腹抽取病例及对照组外周血2 ml，EDTA抗凝，冻存于-20℃待测。
(2)试剂分离纯化试剂盒(Puregene DNA isolarion Kits)为Gentra公司产品；Taq DNA聚合酶、dNTPmix、Hin6I限制性内切酶及分子量标准PUC19DNA/MspI为MBI公司产品；EZ Spin column PCR Product Purification Kit为Sangon公司产品。
(3)引物设计和合成根据Balogh等[3]设计的引物，上游序列5’ACT TCC AGG ACC GCC TTT GGA GGC3’，下游序列5’GT TGA CGC CCC GGG GCA CCG-3’，下游序列3’端下划线的G为一错配碱基(原为A)，可以在正常序列(GCGC)中引入一个Hin6I酶切位点，而在变异序列(GCTC)中无Hin6I酶切位点。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
(4)仪器PE9600型扩增仪系美国PE公司产品；台式低温高速离心机为美国Sigma产品，KODAK1D型凝胶成像系统购自美国IEC公司。
2.方法
(1)基因组DNA抽提取300 μl全血加入900 μl红细胞裂解液，充分混合，室温下孵育1分钟，在相对离心力(RCF)13000~16000 g下离心20秒钟，留下可见的白细胞层，再加入300 μl细胞裂解液混匀，然后经蛋白质沉淀、DNA沉淀、溶解，快速分离DNA。
(2)聚合酶链反应反应体系及条件参照文献[3]并略加改进。总体积为25 μl，含200 μmol/l dNTP，上、下游引物各10 pmol, 2.0 mmol/L MgCl2, 0.4 UTaq酶和0.5 μgDNA模板。反应条件为95℃3 min；循环：94℃1 mim，55℃1 min，72℃1 min，共35个循环；延伸72℃10 min。PCR扩增产物为114 bpDNA片段。
(3)限制性内切酶分析产物经EZ Spin column PCR Product Purification Kit纯化，取纯化的产物10 μl，用限制性内切酶Hin 6 I10U,37℃消化过夜，反应体积20 μl，取5 μl消化后产物在30 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察结果。
(4)基因型鉴定PCR扩增产物114 bp片段中存在一个Hin6酶切位点，可将片段切成94 bp、20 bp两个片段，当FⅩⅢa亚单位2号外显子上的34号密码子发生GT突变，导致其编码的缬氨酸被亮氨酸替代时，则消除了Hin6酶切点，因此，根据琼脂糖凝胶电泳所见区带的位置，以PUC19DNA/MspI/Maker作为标准分子量，从而鉴定基因型为突变纯合子或Val34Leu杂合子或Val34野生型。
3.统计学处理
采用SPSS10.0 for windows统计软件对组间基因型频率的差异进行χ2检验。
结果
1.基因型电泳图谱PCR产物经Hin6I酶切后琼脂糖凝胶电泳只可见94 bp一条区带，则受检个体为Val34野生型(20 bp片段分子量较小而难以显示)，如可见114 bp和94 bp两条区带者为Val34Leu杂合子，只可见114 bp条带者为Leu34突变纯合子，见图1。
1，2，3，5，6，7：Val/Val；8：Val/Leu杂合子；
4：酶切前PCR产物；M: PUC19DNA/MspI/Maker图1FⅩⅢVal34Leu基因型电泳图
2.两组FⅩⅢVal34Leu基因型分布频率比较对照组FⅩⅢVal34Leu杂合突变频率为1.7%，Leu34等位基因频率为0.8%，脑梗死组的Val/Leu杂合突变率为3.8%，对照组为1.7%，两组均未见纯合突变型。两组基因型及等位基因分布频率比较均无统计学差异(P>0.05)。见表1。
讨论
FⅩⅢ是由2 a亚单位和2 b亚单位组成的四聚体，分子量为320 kb,活性部位在a亚单位，对FⅩⅢ亚单位缺失者的基因研究中发现了四种突变，其中编码FⅩⅢa亚单位基因的第2外显子163位有GT点突变，使a亚单位34位的缬氨酸变成亮氨酸(FⅩⅢVal34Leu)，故人群中出现三种基因型(多态性)：野生型Val/Val，杂合突变型Val/Leu，纯合突变型Leu/Leu。多数研究认为，Val/Leu突变可能会防止病人的血栓形成，但可能是原发性脑出血的一种危险因素[1，2，4]。也有报道认为Val34Leu突变与血栓形成没有明显关系，而同源Leu34等位基因才具有保护性作用，其原因在于这种等位基因可以增加血液中FⅩⅢ的浓度，从而加强了纤维蛋白交联的形成。
不同种族、不同国家FⅩⅢVal34Leu多态性基因频率的差异性很大，这可能是造成血栓性疾病在不同地区发生率不同的原因之一。据国外文献报道[5]，澳洲人基因频率Val34为73%，Leu34为27%，德国人Val34为89%，Leu34为11%，日本人Val34与Leu34的频率分别为99%和1%。我们研究106例脑梗死患者和120例正常人的FⅩⅢVal34Leu基因频率，结果显示，正常汉族人群中Leu34等位基因频率为0.8%，明显低于白种人，与日本人群相似[6]，与国内谢汝萍等[4]的研究结果(0.7%)基本一致，表明了黄种人(汉族)基因频率比白种人低，FⅩⅢVal34Leu突变频率在脑梗死与正常人组之间的差异无显著性，提示FⅩⅢVal34Leu可能并非汉族人群血栓性疾病的保护性遗传因素[7，8]，采用PCRRFLP法检测凝血因子ⅩⅢVal34Leu突变，对研究FⅩⅢ多态性与心脑血管性疾病的关系有一定意义。
参考文献
［1］Kohler HP,Stickland MH,OsseiGerning N,et al.Association of a common polymorphism in the factor ⅩⅢ gene with myocardial infarction［J］.Thromb Haemost，1998，79:8-13.
［2］Elbaz A,Poirier O,Canaple S,et al.The association between the Val34Leu polymorphism in the factor ⅩⅢ gene and brain infarction［J］.Blood，2000，95:586-591.
［3］Balogh I,Szoke G,Karpati L,et al. Val34Leu polymorphism of plasma factor ⅩⅢ:biochemistry and epidemiology in familial thrombophilia［J］.Blood，2000，96:2479-2486.
［4］谢汝萍，杨志杰，于敏，等.凝血因子ⅩⅢ基因Val34Leu突变与脑出血神经功能的相关性研究［J］.现代康复，2001，5(2)：92-93.
［5］Kangsadalampai S,Board PG.The Val34Leu polymorphism in the A subunit of coagulation factor ⅩⅢ contributes to the large normal range in activity and demonstratrates that the activation peptide plays a role in catalytic activity［J］.Blood, 1998, 92(8): 2766-2770.
［6］Cho KH, Kim BC, Kim MK, et al. No association of factor ⅩⅢVal34Leu polymorphism with primary intracerebral hemorrhage and healthy controls in Korean population［J］.J Korean Med sci，2002,17(2):249-253.
［7］涂传清，吴建增，谢春英，等.深圳地区汉族人凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因多态性研究［J］.广东医学院学报，2004，22(6)：566-567.
［8］涂传清，吴建增，谢春英，等.汉族人群凝血因子ⅩⅢVal34Leu多态性与动静脉血栓性疾病的关系［J］.中国临床康复，2005，9(1)：70-71.
(收稿日期：2006-04-10修回日期：2006-06-05)
(编辑：梁明佩英文审校：钟京梓)
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