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摘要：目的 观察心痛方对冠心病合并颈动脉斑块患者P选择素（PS）、P选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）、血小板-白细胞聚集体（PLA）、血小板单核细胞聚集体（PMA）的影响，探讨心痛方临床疗效的作用机制。方法 将60例患者随机分为心痛方组和对照组，每组30例。心痛方组服用心痛方，对照组服用拜阿司匹林、阿托伐他汀钙，疗程均为2个月。采用流式细胞术检测治疗前后患者PS、PSGL-1、PLA、PMA的表达量。结果 心痛方与对照药物均能明显抑制PS、PSGL-1、PLA、PMA的表达（P<0.01），治疗组对PLA、PMA的影响优于对照组（P<0.05）。结论 心痛方对PS、PSGL-1、PLA、PMA的表达有明显抑制作用，说明心痛方能通过抑制血小板-白细胞相互反应，减少冠心病合并颈动脉斑块患者的炎症反应。
关键词：心痛方；冠心病；颈动脉斑块；P选择素；P选择素糖蛋白配体-1；血小板-白细胞聚集体；血小板单核细胞聚集体
中图分类号：R259.414；R259.435 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）01-0019-03
冠心病与颈动脉粥样斑块同属动脉粥样硬化（AS）性疾病，因此，国际上已将颈动脉斑块形态和面积作为冠状动脉病变和心血管事件的重要危险因素[1]。目前认为AS是一种炎症性疾病[2]，其过程始终伴随炎症反应，血小板-白细胞（PLT-WBC）相互反应促使血小板、白细胞相互聚集、活化，并释放炎性递质，参与炎症反应。P选择素（PS）/P选择素糖蛋白配体-1 （PSGL-1）在AS炎症反应过程中具有重要意义，二者不仅促进PLT-WBC相互聚集，在白细胞、血小板被活化后， PS/PSGL-1等通过相互结合以及纤维蛋白原的桥接作用形成血小板-白细胞聚集体（PLA）、血小板-单核细胞聚集体（PMA）[3]，进一步促进炎症反应，干预PLT-WBC相互反应过程中的上述指标是治疗冠心病及颈动脉斑块等AS疾病的重要靶点。心痛方是本院临床验方，对冠心病具有良好的临床疗效[4]。本研究采用流式细胞术检测冠心病合并颈动脉斑块患者治疗前后PS、PSGl-1等的变化，探讨其临床疗效的分子机制。
1 临床资料
1.1 诊断标准
1.1.1 西医诊断标准 冠心病参照2010年发布的《冠状动脉粥样硬化性心脏病诊断标准》[5]。依据文献[6-7]，将颈动脉内膜中层厚度≥1.2 mm定义为粥样硬化斑块形成；颈动脉Crouse积分是分别将同侧颈总动脉、颈内动脉各孤立的颈动脉硬化斑块的最大厚度相加，得出该颈动脉斑块的积分，双侧颈动脉斑块积分之和即为颈动脉斑块总积分。
1.1.2 中医诊断标准 参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》相关标准[8]。
1.1.2.1 胸痹心痛合并眩晕 （1）临床表现：①左侧胸膺或膻中处突发憋闷而痛，疼痛性质表现为隐痛、胀痛、刺痛、绞痛；②疼痛可窜及肩背、前臂、胃脘部等甚可沿手少阴、手厥阴经循行处窜至中指或小指，并兼心悸；③轻者可仅表现为胸闷憋气，呼吸不畅。（2）发病特点：突然发病，时发时止，反复发作。（3）诱发因素：情志波动，气候变化，饮食不节，劳累过度。（4）心电图检查有缺血性改变或运动试验阳性或冠脉造影确诊者。（5）头晕目眩和有颈动脉斑块客观证据。具备（1）、（4）、（5）项，可诊断为胸痹心痛合并眩晕。
1.1.2.2 痰瘀互结气郁证 （1）主证：①胸痛、胸闷。胸部刺痛、胀痛或绞痛，固定不移，入夜更甚，或痛引肩背或臂内侧，胸胁胀闷或胸闷如窒而痛；②头晕目眩；③气滞。胸胁不舒，时轻时重，常随情志改变，情绪不宁，善太息；④多痰。口吐痰涎，咽中痰阻，体胖、肢体困重、体质指数>25 kg/m2。（2）次证：①口唇紫绀，舌质紫黯或见瘀斑瘀点，苔腻或滑，舌下系带迂、紫黯或有瘀点瘀斑；②心悸不宁，活动后气促，失眠健忘；③脉细涩或滑或弦。具备主证①、②、④项及以上，次证①、③项及以上，可诊断为痰瘀互结气郁证。
1.2 纳入标准
符合冠心病合并颈动脉斑块、胸痹心痛合并眩晕属痰瘀互结气郁证诊断，年龄40～75岁，且知情同意。
1.3 排除标准
不符合中、西医诊断标准，其他疾患引起胸痛，或年龄在40岁以下、75岁以上者；颈动脉超声检查不符合斑块形成标准者；不属于痰瘀互结气郁证或以其他合并证为主者；有重大肝肾疾病、近期活动性出血、重度心肺疾患、严重胃肠疾患、肿瘤及精神疾病患者；不宜停用当前治疗药物者；过敏体质及对多种药物过敏者；依从性差、不配合治疗或不愿意参加试验者。
1.4 一般资料
病例来源于2012年10月-2013年3月本院心内科、神经内科病房及心内科门诊患者，共60例。根据患者就诊顺序，采用随机数字表法随机分为2组，每组30例。心痛方组男13例，女17例，平均年龄（62.43±6.25）岁，平均病程（5.6±2.9）年，合并高血压21例、高脂血症11例、糖尿病7例；对照组男16例，女14例，平均年龄（63.46±6.11）岁，平均病程（5.9±2.5）年，合并高血压17例、高脂血症14例、糖尿病3例。2组在性别、年龄、冠心病病程及合并症方面差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
2 方法
2.1 治疗方法
对照组：拜阿司匹林（拜耳公司，100 mg/片，批号BJ0927）口服，100 mg/次，1次/d；阿托伐他汀钙（河南天方药业股份有限公司，20 mg/粒，批号121110119）口服，20 mg/次，1次/d。心痛方组：心痛方（柴胡10 g，瓜蒌15 g，川芎10 g，桃仁10 g，蒲黄5 g，芥子5 g，郁金10 g，九香虫10 g，甘草5 g。超微饮片全部购自本院中药房），每日1剂，冲服，2次/d。2组均治疗2个月。治疗期间，凡合并高血压病者继续正规降压治疗，合并糖尿病者继续正规降糖治疗，高脂血症者停服其他调脂药，其他中西药物均停用。 2.2 检测指标及方法
2.2.1 流式细胞术全血法检测白细胞表面P选择素糖蛋白配体-1的表达 取抗凝血10 μL加入流式上机管中，再分别加入CD45 PE-CY7抗体2 μL、CD162 PE抗体4 μL，充分混匀，室温下避光孵育20～30 min，加入BPS缓冲液300 μL，上机检测，收集总细胞数3 0000个，以PE-CY7表达确定白细胞，以PE与PE-CY7双表达确定PSGL-1在白细胞中的表达百分比。流式细胞仪，荧光抗体标记Hu CD45 PE-CY7 MAB 100TST HI30等由美国BD公司提供。
2.2.2 流式细胞术全血法检测血小板表面P选择素及全血血小板-白细胞聚集体、血小板单核细胞聚集体的表达 取抗凝血10 μL加入流式上机管中，再分别加入CD45 PE-CY7抗体2 μL及CD41A PE、CD62p PE-CY5抗体4 μL，室温下避光孵育20～30 min，加入BPS缓冲液300 μL，上机检测，收集单核细胞数1 0000个，通过PE表达确定血小板，以PE、PE-CY5双表达确定PS在血小板中表达的百分比；以PE-CY7确定白细胞，以PE在白细胞的表达确定PLA表达的百分比；以PE在单核细胞上的表达确定PMA表达的百分比。
2.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行分析。计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验或秩和检验；计量资料进行正态分布及方差齐性检验，以—x±s表示，组内治疗前后采用配对t检验，组间比较用成组t检验，不满足正态性分布及方差齐性者采用非参数检验。采用双侧检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 2组治疗前后P选择素、P选择素糖蛋白配体-1比较
治疗前心痛方组和对照组PS、PSGL-1比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。治疗后2组PS、PSGL-1均显著降低（P<0.01），治疗后PS、PSGL-1组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。
4 讨论
AS发展过程始终伴随着炎症反应，具备变质、渗出、增生的基本病理改变。PLT-WBC相互反应促使血小板、白细胞相互聚集、活化，并释放炎性递质，参与炎症反应，继而与斑块形成、破裂及血栓形成密切相关[9]。PS通过与PSGL-1结合启动并活化血小板，促使炎症反应、介导血栓形成，是启动和维持PLT-WBC相互反应的重要物质；PLA是在白细胞、血小板被活化后，通过PS/PSGL-1、CD40/CD40L（以PS/PSGL-1为主）等配体相互结合以及纤维蛋白原的桥接作用而形成[3]；PMA是血小板、单核细胞的聚集产物，是PLA中最重要的一种， PLA尤其是PMA是评价血小板活化的重要指标，是反映PLT-WBC相互反应程度更为敏感的指标[10]。因此PS/PSGL-1等是冠心病及颈动脉斑块的重要炎症指标，有助于了解炎症反应的程度、评估药物疗效。
心痛方是依据陈士铎“心痛治肝”理论组方，功用疏肝豁痰化瘀，主治痰瘀互结气郁证胸痹心痛。方中柴胡遵“木郁达之”之旨，疏肝解郁，使“肝气通则心气和”，瓜蒌清热化痰、宽胸散结，共奏肝心并治之功，同为君药；川芎搜肝气、补肝血、润肝燥，桃仁苦以泄滞血、甘以生新血，蒲黄导瘀结而治气血凝滞之痛，三者共为臣药；郁金为佐，佐君药疏肝解郁，助臣药行气活血化瘀；九香虫为使，走窜络脉，理气止痛而不伤胃，并能理肝胃之气、行膈脘之滞以助脾胃之健运，以绝生痰之源。
既往研究多测定血浆中可溶性PS/PSGL-1等指标，本研究采用流式细胞术测定细胞表面表达量，提高了指标的精确度。结果显示，心痛方对PS、PSGL-1、PLA、PMA有明显抑制作用，说明其能抑制冠心病合并颈动脉斑块患者的炎症反应，阻断血小板、白细胞的聚集、黏附，这可能是其临床疗效的分子机制之一。
参考文献：
[1] Oh PC， Han SH， Kim JS， et al. Carotid plaque in absence of traditional and non-traditional cardiovascular risk factors[J]. International of Cardiology，2010，143：57-59.
[2] Russell Ross. Atherosclerosis-An inflammatory disease[J]. The New England Journal of Medicine，1999，340（2）：115-126.
[3] Marquardt L， Anders C， Buggle F， et al. Leukocyte-platelet aggregates in acuteand subacute ischemic stroke[J]. Cerebrovasc Dis，2009，28：276-282.
[4] 范金茹，刘凤英.疏肝化瘀豁痰法治疗不稳定型心绞痛疗效及对血小板-白细胞相互作用的干预观察[J].中国中医急症，2008，17（12）：1653-l655.
[5] 中华人民共和国卫生部.冠状动脉粥样硬化性心脏病诊断标准[S].北京：中国质检出版社，2010：1-4.
[6] 常建宁.颈动脉内-中层厚度及斑块性质和超敏C反应蛋白对冠心病的预测研究[J].中西结合心脑血管病杂志，2010，8（9）：1050-1052.
[7] 曹勇.颈动脉超声与血尿酸检查在冠心病诊断中的应用研究[J].西部医学，2010，22（11）：2014-2016.
[8] 郑筱萸.中药新药临床研究指导原则（试行）[S].北京：中国医药科技出版社，2002：68-73.
[9] 贺石林，范金茹. Platelet-leukocyte interaction and thrombosis[J]. 血栓与止血学，2007，13（2）：51-52.
[10] 杨大浩，谭宁，何鹏程，等.血小板-白细胞聚集体与急性冠状动脉综合征的相关性[J].中华心血管病杂志，2012，40（6）：482-486.
关键词：心痛方；冠心病；颈动脉斑块；P选择素；P选择素糖蛋白配体-1；血小板-白细胞聚集体；血小板单核细胞聚集体
中图分类号：R259.414；R259.435 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）01-0019-03
冠心病与颈动脉粥样斑块同属动脉粥样硬化（AS）性疾病，因此，国际上已将颈动脉斑块形态和面积作为冠状动脉病变和心血管事件的重要危险因素[1]。目前认为AS是一种炎症性疾病[2]，其过程始终伴随炎症反应，血小板-白细胞（PLT-WBC）相互反应促使血小板、白细胞相互聚集、活化，并释放炎性递质，参与炎症反应。P选择素（PS）/P选择素糖蛋白配体-1 （PSGL-1）在AS炎症反应过程中具有重要意义，二者不仅促进PLT-WBC相互聚集，在白细胞、血小板被活化后， PS/PSGL-1等通过相互结合以及纤维蛋白原的桥接作用形成血小板-白细胞聚集体（PLA）、血小板-单核细胞聚集体（PMA）[3]，进一步促进炎症反应，干预PLT-WBC相互反应过程中的上述指标是治疗冠心病及颈动脉斑块等AS疾病的重要靶点。心痛方是本院临床验方，对冠心病具有良好的临床疗效[4]。本研究采用流式细胞术检测冠心病合并颈动脉斑块患者治疗前后PS、PSGl-1等的变化，探讨其临床疗效的分子机制。
1 临床资料
1.1 诊断标准
1.1.1 西医诊断标准 冠心病参照2010年发布的《冠状动脉粥样硬化性心脏病诊断标准》[5]。依据文献[6-7]，将颈动脉内膜中层厚度≥1.2 mm定义为粥样硬化斑块形成；颈动脉Crouse积分是分别将同侧颈总动脉、颈内动脉各孤立的颈动脉硬化斑块的最大厚度相加，得出该颈动脉斑块的积分，双侧颈动脉斑块积分之和即为颈动脉斑块总积分。
1.1.2 中医诊断标准 参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》相关标准[8]。
1.1.2.1 胸痹心痛合并眩晕 （1）临床表现：①左侧胸膺或膻中处突发憋闷而痛，疼痛性质表现为隐痛、胀痛、刺痛、绞痛；②疼痛可窜及肩背、前臂、胃脘部等甚可沿手少阴、手厥阴经循行处窜至中指或小指，并兼心悸；③轻者可仅表现为胸闷憋气，呼吸不畅。（2）发病特点：突然发病，时发时止，反复发作。（3）诱发因素：情志波动，气候变化，饮食不节，劳累过度。（4）心电图检查有缺血性改变或运动试验阳性或冠脉造影确诊者。（5）头晕目眩和有颈动脉斑块客观证据。具备（1）、（4）、（5）项，可诊断为胸痹心痛合并眩晕。
1.1.2.2 痰瘀互结气郁证 （1）主证：①胸痛、胸闷。胸部刺痛、胀痛或绞痛，固定不移，入夜更甚，或痛引肩背或臂内侧，胸胁胀闷或胸闷如窒而痛；②头晕目眩；③气滞。胸胁不舒，时轻时重，常随情志改变，情绪不宁，善太息；④多痰。口吐痰涎，咽中痰阻，体胖、肢体困重、体质指数>25 kg/m2。（2）次证：①口唇紫绀，舌质紫黯或见瘀斑瘀点，苔腻或滑，舌下系带迂、紫黯或有瘀点瘀斑；②心悸不宁，活动后气促，失眠健忘；③脉细涩或滑或弦。具备主证①、②、④项及以上，次证①、③项及以上，可诊断为痰瘀互结气郁证。
1.2 纳入标准
符合冠心病合并颈动脉斑块、胸痹心痛合并眩晕属痰瘀互结气郁证诊断，年龄40～75岁，且知情同意。
1.3 排除标准
不符合中、西医诊断标准，其他疾患引起胸痛，或年龄在40岁以下、75岁以上者；颈动脉超声检查不符合斑块形成标准者；不属于痰瘀互结气郁证或以其他合并证为主者；有重大肝肾疾病、近期活动性出血、重度心肺疾患、严重胃肠疾患、肿瘤及精神疾病患者；不宜停用当前治疗药物者；过敏体质及对多种药物过敏者；依从性差、不配合治疗或不愿意参加试验者。
1.4 一般资料
病例来源于2012年10月-2013年3月本院心内科、神经内科病房及心内科门诊患者，共60例。根据患者就诊顺序，采用随机数字表法随机分为2组，每组30例。心痛方组男13例，女17例，平均年龄（62.43±6.25）岁，平均病程（5.6±2.9）年，合并高血压21例、高脂血症11例、糖尿病7例；对照组男16例，女14例，平均年龄（63.46±6.11）岁，平均病程（5.9±2.5）年，合并高血压17例、高脂血症14例、糖尿病3例。2组在性别、年龄、冠心病病程及合并症方面差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
2 方法
2.1 治疗方法
对照组：拜阿司匹林（拜耳公司，100 mg/片，批号BJ0927）口服，100 mg/次，1次/d；阿托伐他汀钙（河南天方药业股份有限公司，20 mg/粒，批号121110119）口服，20 mg/次，1次/d。心痛方组：心痛方（柴胡10 g，瓜蒌15 g，川芎10 g，桃仁10 g，蒲黄5 g，芥子5 g，郁金10 g，九香虫10 g，甘草5 g。超微饮片全部购自本院中药房），每日1剂，冲服，2次/d。2组均治疗2个月。治疗期间，凡合并高血压病者继续正规降压治疗，合并糖尿病者继续正规降糖治疗，高脂血症者停服其他调脂药，其他中西药物均停用。 2.2 检测指标及方法
2.2.1 流式细胞术全血法检测白细胞表面P选择素糖蛋白配体-1的表达 取抗凝血10 μL加入流式上机管中，再分别加入CD45 PE-CY7抗体2 μL、CD162 PE抗体4 μL，充分混匀，室温下避光孵育20～30 min，加入BPS缓冲液300 μL，上机检测，收集总细胞数3 0000个，以PE-CY7表达确定白细胞，以PE与PE-CY7双表达确定PSGL-1在白细胞中的表达百分比。流式细胞仪，荧光抗体标记Hu CD45 PE-CY7 MAB 100TST HI30等由美国BD公司提供。
2.2.2 流式细胞术全血法检测血小板表面P选择素及全血血小板-白细胞聚集体、血小板单核细胞聚集体的表达 取抗凝血10 μL加入流式上机管中，再分别加入CD45 PE-CY7抗体2 μL及CD41A PE、CD62p PE-CY5抗体4 μL，室温下避光孵育20～30 min，加入BPS缓冲液300 μL，上机检测，收集单核细胞数1 0000个，通过PE表达确定血小板，以PE、PE-CY5双表达确定PS在血小板中表达的百分比；以PE-CY7确定白细胞，以PE在白细胞的表达确定PLA表达的百分比；以PE在单核细胞上的表达确定PMA表达的百分比。
2.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行分析。计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验或秩和检验；计量资料进行正态分布及方差齐性检验，以—x±s表示，组内治疗前后采用配对t检验，组间比较用成组t检验，不满足正态性分布及方差齐性者采用非参数检验。采用双侧检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 2组治疗前后P选择素、P选择素糖蛋白配体-1比较
治疗前心痛方组和对照组PS、PSGL-1比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。治疗后2组PS、PSGL-1均显著降低（P<0.01），治疗后PS、PSGL-1组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。
4 讨论
AS发展过程始终伴随着炎症反应，具备变质、渗出、增生的基本病理改变。PLT-WBC相互反应促使血小板、白细胞相互聚集、活化，并释放炎性递质，参与炎症反应，继而与斑块形成、破裂及血栓形成密切相关[9]。PS通过与PSGL-1结合启动并活化血小板，促使炎症反应、介导血栓形成，是启动和维持PLT-WBC相互反应的重要物质；PLA是在白细胞、血小板被活化后，通过PS/PSGL-1、CD40/CD40L（以PS/PSGL-1为主）等配体相互结合以及纤维蛋白原的桥接作用而形成[3]；PMA是血小板、单核细胞的聚集产物，是PLA中最重要的一种， PLA尤其是PMA是评价血小板活化的重要指标，是反映PLT-WBC相互反应程度更为敏感的指标[10]。因此PS/PSGL-1等是冠心病及颈动脉斑块的重要炎症指标，有助于了解炎症反应的程度、评估药物疗效。
心痛方是依据陈士铎“心痛治肝”理论组方，功用疏肝豁痰化瘀，主治痰瘀互结气郁证胸痹心痛。方中柴胡遵“木郁达之”之旨，疏肝解郁，使“肝气通则心气和”，瓜蒌清热化痰、宽胸散结，共奏肝心并治之功，同为君药；川芎搜肝气、补肝血、润肝燥，桃仁苦以泄滞血、甘以生新血，蒲黄导瘀结而治气血凝滞之痛，三者共为臣药；郁金为佐，佐君药疏肝解郁，助臣药行气活血化瘀；九香虫为使，走窜络脉，理气止痛而不伤胃，并能理肝胃之气、行膈脘之滞以助脾胃之健运，以绝生痰之源。
既往研究多测定血浆中可溶性PS/PSGL-1等指标，本研究采用流式细胞术测定细胞表面表达量，提高了指标的精确度。结果显示，心痛方对PS、PSGL-1、PLA、PMA有明显抑制作用，说明其能抑制冠心病合并颈动脉斑块患者的炎症反应，阻断血小板、白细胞的聚集、黏附，这可能是其临床疗效的分子机制之一。
参考文献：
[1] Oh PC， Han SH， Kim JS， et al. Carotid plaque in absence of traditional and non-traditional cardiovascular risk factors[J]. International of Cardiology，2010，143：57-59.
[2] Russell Ross. Atherosclerosis-An inflammatory disease[J]. The New England Journal of Medicine，1999，340（2）：115-126.
[3] Marquardt L， Anders C， Buggle F， et al. Leukocyte-platelet aggregates in acuteand subacute ischemic stroke[J]. Cerebrovasc Dis，2009，28：276-282.
[4] 范金茹，刘凤英.疏肝化瘀豁痰法治疗不稳定型心绞痛疗效及对血小板-白细胞相互作用的干预观察[J].中国中医急症，2008，17（12）：1653-l655.
[5] 中华人民共和国卫生部.冠状动脉粥样硬化性心脏病诊断标准[S].北京：中国质检出版社，2010：1-4.
[6] 常建宁.颈动脉内-中层厚度及斑块性质和超敏C反应蛋白对冠心病的预测研究[J].中西结合心脑血管病杂志，2010，8（9）：1050-1052.
[7] 曹勇.颈动脉超声与血尿酸检查在冠心病诊断中的应用研究[J].西部医学，2010，22（11）：2014-2016.
[8] 郑筱萸.中药新药临床研究指导原则（试行）[S].北京：中国医药科技出版社，2002：68-73.
[9] 贺石林，范金茹. Platelet-leukocyte interaction and thrombosis[J]. 血栓与止血学，2007，13（2）：51-52.
[10] 杨大浩，谭宁，何鹏程，等.血小板-白细胞聚集体与急性冠状动脉综合征的相关性[J].中华心血管病杂志，2012，40（6）：482-486.