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摘要主要考察了水的添加量、催化剂用量、醇油摩尔比、有机溶剂的添加、反应时间、反应温度、甲醇流加方式对生物柴油转化率的影响。结果表明，脂肪酶基因工程菌NJY169产脂肪酶制备生物柴油的最佳工艺条件：水的添加量为0.15%， 醇油摩尔比为3∶1，催化剂用量14%，反应温度30 ℃，反应时间36 h，甲醇流加方式是分3次加入，获得的生物柴油最高转化率为89%。
关键词基因工程菌；脂肪酶；生物柴油
中图分类号TQ645文献标识码A文章编号0517-6611（2014）24-08116-02
The Application of a Lipase Prepared from an Engineered Fungal Strain NJY169 in the Production of Biodiesel
YAN Lijuan et al （Yun nan Wonfine Biotechnology Co. Ltd， Kunming， Yunnan 650117）
AcstractEffects of water addition amount， dosage of enzymes， the molar ratio of methanol and oil， the amount of organic solvent， duration/temperature of reactions and methods of fedbatch addition of methano on biodiesel conversion rate were investigated. The results showed that the optimal conditions of a lipase produced from an engineered fungal strain NJY169 in the production of biodiesel are： water amount 0.15%， the molar ratio of methanol and oil 3∶1， dosage of enzymes 14%， reaction temperature 30 ℃， reaction duration 36 h， methanol adding for 3 times， the highest conversion rate of biodiesel is 89%.
Key words Engineered fungal strain； Lipase； Biodiesel
脂肪酶因其独特的生物学和化学性质广泛应用于不同工业领域，尤其是在生物柴油制備中。生物柴油作为柴油的代用品是一种环境友好的绿色清洁燃料，发展生物柴油对于保护石油安全、保护环境、促进国民经济的发展具有十分重要的意义。由于脂肪酶催化生产生物柴油具有反应条件温和、产物易回收、醇用量少、无污染排放等优点，因而已引起人们广泛的重视。
1材料与方法
1.1主要试剂及仪器
1.1.1主要试剂。甲醇、正己烷等生化试剂均为进口分析纯，菜籽油购自超市，脂肪酶基因工程菌NJY169（7.0 U/mg蛋白）为云南创新生物产业孵化器有限公司实验室制备。
1.1.2主要仪器。GCMS（G1701EB，美国安捷伦公司）；生化培养箱（SGSP02，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；高速冷冻离心机（Centrifuge5810 R，德国eppendorf公司）；恒温调速摇床（YPWL，上海通特电讯设备厂）。
1.2试验流程生物柴油工艺流程见图1。
图1试验流程1.3生物柴油制备条件优化[1-7]
1.3.1 水的添加量。脂肪酶是油水界面酶，水是催化反应中必不可少的物质，但过量的水又会使酶的催化活力下降。通过添加不同量的水0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、025%、0.30%（以油的质量为基准），确定水的最佳添加量。
1.3.2 催化剂用量。脂肪酶作为制备生物柴油的催化剂，不同油脂和不同的反应体系需要适合自身特定的添加量。通过添加不同量的脂肪酶8%、10%、12%、14%、16%、18%（以油的质量为基准），确定脂肪酶最佳添加量。
1.3.3 醇油摩尔比。生物柴油的生成需要添加一定量的甲醇与动物或植物油等中的甘油三酸酯发生酯交换反应，但甲醇太多又会争夺脂肪酶反应中的必须水，影响脂肪酶的催化效力，通过添加2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1的醇油摩尔比确定最佳的醇油摩尔比。
1.3.4 有机溶剂的添加。有机溶剂可以促进底物与酶的接触并使底物更好的溶解，但有机溶剂的添加也会对产物有一定的影响。添加相同体积的叔丁醇、正丁醇、异丁醇、正己烷、石油醚、丙酮（与油体积比1∶1）进行催化反应，确定有机溶剂的最适添加量。
1.3.5 反应温度。对于不同的催化剂及不同的反应体系反应温度不同，过高的温度导致催化剂失活，温度太低又使底物反应不完全。在25、30、35、40、45、50、55 ℃下进行催化反应，确定最佳催化温度。
1.3.6 反应时间。对于不同的催化剂及不同的反应体系反应时间不同，时间长副产物增加，时间短反应不完全，浪费底物和催化剂。在12、24、36、48、60、72 h下进行催化反应，确定最佳反应时间。
1.3.7 甲醇流加方式。甲醇是试验中不可缺少的反应物，大量甲醇对脂肪酶有毒害作用，但可以改变甲醇的流加方式来减少对脂肪酶的毒害。选择1次性加入甲醇反应36 h来测定转化率，和分2、3、4、5、6次加入甲醇来测定转化率。
2结果与分析 2.1 水的添加量由圖2可知，当添加0.15%的水时，生物柴油的转化率最高。
图2水的添加量对生物柴油转化率的影响2.2催化剂用量由图3可知，当脂肪酶的添加量<14%时，随着脂肪酶的增多，生物柴油的转化率也在增大，但脂肪酶添加量超过14%，生物柴油的转化率几乎没有增长。因此确定最佳催化剂用量为14%。
图3脂肪酶用量对生物柴油转化率的影响2.3醇油摩尔比由图4可知，当醇油摩尔比为3∶1时转化率最高，随着醇油摩尔比的增大转化率下降，这可能是醇含量增加对脂肪酶产生毒害作用使转化率下降。因此确定最佳醇油摩尔比为3∶1。
图4醇油摩尔比对生物柴油转化率的影响2.4有机溶剂的添加
2.4.1 不同有机溶剂。由图5可知，添加正己烷转化率最高，因此确定最佳的有机溶剂为正己烷。
图5不同有机溶剂对生物柴油转化率的影响2.4.2 是否添加有机溶剂。配制相同的反应体系（A）和（B），在（A）中加入正己烷，（B）中不加，30 ℃，摇床150 r/min，反应48 h测其转化率，结果见图6。由图6可知，添加正己烷和不加正己烷转化率无明显差异，因此选择不加正己烷，即不添加有机溶剂。
图6有机溶剂的添加对生物柴油转化率的影响2.5反应温度由图7可知，当温度<40 ℃时，随着温度的升高生物柴油的转化率大幅度增加，超过40 ℃生物柴油的转化率逐渐下降，可能是升高温度导致甲醇挥发转化率下降。因此选择最适的催化温度为40 ℃。
图7反应温度对生物柴油转化率的影响2.6反应时间由图8可知，随着时间的增加转化率逐渐增大，36 h后虽然转化率也增大但幅度较小，综合考虑，该试验选择36 h为最佳反应时间。
图8反应时间对生物柴油转化率的影响
2.7甲醇流加方式由图9可知，分3次加入甲醇的转化率最高，因此选择分3次加入甲醇的方式。
图9甲醇添加量对生物柴油转化率的影响3 结论与讨论
该研究以云南创新生物产业孵化器管理有限公司实验室制备的基因工程菌NJY169产脂肪酶为研究对象，对其制备生物柴油的主要工艺：水的添加量、醇油摩尔比、催化剂用量、反应温度和时间、甲醇流加方式进行了初步研究。结果表明，最佳工艺条件为：水的添加量为0.15%， 醇油摩尔比为3∶1，催化剂用量14%，反应温度30 ℃，反应时间36 h，甲醇流加方式是分3次加入，获得的生物柴油最高转化率为89%。
研究发现基因工程菌NJY169产脂肪酶在添加有机溶剂和不添加有机溶剂的情况下转化率无明显差别。一般情况下有机溶剂可以促进底物与酶的接触并使底物更好的溶解，ROYON等[8]通过在反应体系中添加叔丁醇使转化率提高，NABIL等[9]研究表明添加有机溶剂可以促进脂肪酶催化效率的提高，SOUMANOU等[10]研究表明正己烷可以促进转化率提高，LI等[11]用添加叔丁醇的脂肪酶催化生物柴油的转化率达90%以上。而该重组酶在没有有机溶剂的添加下也能达到相同的转化效率，说明该重组酶在无有机溶剂的帮助下可以很好地和底物接触完成反应，有一定的研究和利用价值。
参考文献
[1] PARK E Y，SATO M，KOJIMA S.Lipasecatalyzed biodiesel production from waste activated bleaching earth as raw material in a pilot plant[J].Bioresource Technology，2007，63：84-93.
[2] NIE K L，XIE F，WANG F，et al.Lipase catalyzed methanolysis to produce biodiesel：Optimization of the biodiesel production[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2006，43：142-147.
[3] SHAH S，GUPTA M N.Lipase catalyzed preparation of biodiesel from Jatropha oil in a solvent free system[J].Process Biochemistry，2007，42：409-414.
[4] WANG L，DU W，LIU D H，et al.Lipasecatalyzed biodiesel production from soybean oil deodorizer distillate with absorbent present in tertbutanol system[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2006，43：29-32.
[5] SUNG HO HAA，MAI NGOC LANB，SANG HYUN LEE A，et al.Lipasecatalyzed biodiesel production from soybean oil in ionic liquids[J].Enzyme and Microbial Technology，2007，41：480-483.
[6] LI L L，DU W，LIU D H，et al.Lipasecatalyzed transesterification of rapeseed oils for biodiesel production with a novel organic solvent as the reaction medium[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2006，43：58-62.
[7] LARA PIZARRO A V，PARK E Y.Lipasecatalyzed production of biodiesel fuel from vegetable oils contained in waste activated bleaching earth[J].Process Biochemistry，2003，38：1077-1082.
[8] ROYON D，DAZ M，ELLENRIEDER G，et al.Enzymatic production of Biodiesel from cotton seed oil using tbutanol as a solvent[J].Bioresource Technology，2007，98：648-653.
[9] NABIL M，ALAIN D C，JOSIANE D C，et al.A conformational transition between an open and closed form of human pancreatic lipase revealed by a monoclonal antibody[J].Biochimica et Biophysica Acta，2000，1476：165-172.
[10] SOUMANOU M M，BORNSCHEUER U T.Improvement in lipasecatalyzed synthesis of fatty acid methyl esters from sunflower oil[J].Enzyme and Microbial Technology，2003，33（1）：97-103.
[11] LI L L，DU W，LIU D H，et al.Lipasecatalyzed transesterification of rapeseed oils for biodiesel production with a novel organic solvent as the reaction medium[J].Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic，2006，43：58-62.
关键词基因工程菌；脂肪酶；生物柴油
中图分类号TQ645文献标识码A文章编号0517-6611（2014）24-08116-02
The Application of a Lipase Prepared from an Engineered Fungal Strain NJY169 in the Production of Biodiesel
YAN Lijuan et al （Yun nan Wonfine Biotechnology Co. Ltd， Kunming， Yunnan 650117）
AcstractEffects of water addition amount， dosage of enzymes， the molar ratio of methanol and oil， the amount of organic solvent， duration/temperature of reactions and methods of fedbatch addition of methano on biodiesel conversion rate were investigated. The results showed that the optimal conditions of a lipase produced from an engineered fungal strain NJY169 in the production of biodiesel are： water amount 0.15%， the molar ratio of methanol and oil 3∶1， dosage of enzymes 14%， reaction temperature 30 ℃， reaction duration 36 h， methanol adding for 3 times， the highest conversion rate of biodiesel is 89%.
Key words Engineered fungal strain； Lipase； Biodiesel
脂肪酶因其独特的生物学和化学性质广泛应用于不同工业领域，尤其是在生物柴油制備中。生物柴油作为柴油的代用品是一种环境友好的绿色清洁燃料，发展生物柴油对于保护石油安全、保护环境、促进国民经济的发展具有十分重要的意义。由于脂肪酶催化生产生物柴油具有反应条件温和、产物易回收、醇用量少、无污染排放等优点，因而已引起人们广泛的重视。
1材料与方法
1.1主要试剂及仪器
1.1.1主要试剂。甲醇、正己烷等生化试剂均为进口分析纯，菜籽油购自超市，脂肪酶基因工程菌NJY169（7.0 U/mg蛋白）为云南创新生物产业孵化器有限公司实验室制备。
1.1.2主要仪器。GCMS（G1701EB，美国安捷伦公司）；生化培养箱（SGSP02，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；高速冷冻离心机（Centrifuge5810 R，德国eppendorf公司）；恒温调速摇床（YPWL，上海通特电讯设备厂）。
1.2试验流程生物柴油工艺流程见图1。
图1试验流程1.3生物柴油制备条件优化[1-7]
1.3.1 水的添加量。脂肪酶是油水界面酶，水是催化反应中必不可少的物质，但过量的水又会使酶的催化活力下降。通过添加不同量的水0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、025%、0.30%（以油的质量为基准），确定水的最佳添加量。
1.3.2 催化剂用量。脂肪酶作为制备生物柴油的催化剂，不同油脂和不同的反应体系需要适合自身特定的添加量。通过添加不同量的脂肪酶8%、10%、12%、14%、16%、18%（以油的质量为基准），确定脂肪酶最佳添加量。
1.3.3 醇油摩尔比。生物柴油的生成需要添加一定量的甲醇与动物或植物油等中的甘油三酸酯发生酯交换反应，但甲醇太多又会争夺脂肪酶反应中的必须水，影响脂肪酶的催化效力，通过添加2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1的醇油摩尔比确定最佳的醇油摩尔比。
1.3.4 有机溶剂的添加。有机溶剂可以促进底物与酶的接触并使底物更好的溶解，但有机溶剂的添加也会对产物有一定的影响。添加相同体积的叔丁醇、正丁醇、异丁醇、正己烷、石油醚、丙酮（与油体积比1∶1）进行催化反应，确定有机溶剂的最适添加量。
1.3.5 反应温度。对于不同的催化剂及不同的反应体系反应温度不同，过高的温度导致催化剂失活，温度太低又使底物反应不完全。在25、30、35、40、45、50、55 ℃下进行催化反应，确定最佳催化温度。
1.3.6 反应时间。对于不同的催化剂及不同的反应体系反应时间不同，时间长副产物增加，时间短反应不完全，浪费底物和催化剂。在12、24、36、48、60、72 h下进行催化反应，确定最佳反应时间。
1.3.7 甲醇流加方式。甲醇是试验中不可缺少的反应物，大量甲醇对脂肪酶有毒害作用，但可以改变甲醇的流加方式来减少对脂肪酶的毒害。选择1次性加入甲醇反应36 h来测定转化率，和分2、3、4、5、6次加入甲醇来测定转化率。
2结果与分析 2.1 水的添加量由圖2可知，当添加0.15%的水时，生物柴油的转化率最高。
图2水的添加量对生物柴油转化率的影响2.2催化剂用量由图3可知，当脂肪酶的添加量<14%时，随着脂肪酶的增多，生物柴油的转化率也在增大，但脂肪酶添加量超过14%，生物柴油的转化率几乎没有增长。因此确定最佳催化剂用量为14%。
图3脂肪酶用量对生物柴油转化率的影响2.3醇油摩尔比由图4可知，当醇油摩尔比为3∶1时转化率最高，随着醇油摩尔比的增大转化率下降，这可能是醇含量增加对脂肪酶产生毒害作用使转化率下降。因此确定最佳醇油摩尔比为3∶1。
图4醇油摩尔比对生物柴油转化率的影响2.4有机溶剂的添加
2.4.1 不同有机溶剂。由图5可知，添加正己烷转化率最高，因此确定最佳的有机溶剂为正己烷。
图5不同有机溶剂对生物柴油转化率的影响2.4.2 是否添加有机溶剂。配制相同的反应体系（A）和（B），在（A）中加入正己烷，（B）中不加，30 ℃，摇床150 r/min，反应48 h测其转化率，结果见图6。由图6可知，添加正己烷和不加正己烷转化率无明显差异，因此选择不加正己烷，即不添加有机溶剂。
图6有机溶剂的添加对生物柴油转化率的影响2.5反应温度由图7可知，当温度<40 ℃时，随着温度的升高生物柴油的转化率大幅度增加，超过40 ℃生物柴油的转化率逐渐下降，可能是升高温度导致甲醇挥发转化率下降。因此选择最适的催化温度为40 ℃。
图7反应温度对生物柴油转化率的影响2.6反应时间由图8可知，随着时间的增加转化率逐渐增大，36 h后虽然转化率也增大但幅度较小，综合考虑，该试验选择36 h为最佳反应时间。
图8反应时间对生物柴油转化率的影响
2.7甲醇流加方式由图9可知，分3次加入甲醇的转化率最高，因此选择分3次加入甲醇的方式。
图9甲醇添加量对生物柴油转化率的影响3 结论与讨论
该研究以云南创新生物产业孵化器管理有限公司实验室制备的基因工程菌NJY169产脂肪酶为研究对象，对其制备生物柴油的主要工艺：水的添加量、醇油摩尔比、催化剂用量、反应温度和时间、甲醇流加方式进行了初步研究。结果表明，最佳工艺条件为：水的添加量为0.15%， 醇油摩尔比为3∶1，催化剂用量14%，反应温度30 ℃，反应时间36 h，甲醇流加方式是分3次加入，获得的生物柴油最高转化率为89%。
研究发现基因工程菌NJY169产脂肪酶在添加有机溶剂和不添加有机溶剂的情况下转化率无明显差别。一般情况下有机溶剂可以促进底物与酶的接触并使底物更好的溶解，ROYON等[8]通过在反应体系中添加叔丁醇使转化率提高，NABIL等[9]研究表明添加有机溶剂可以促进脂肪酶催化效率的提高，SOUMANOU等[10]研究表明正己烷可以促进转化率提高，LI等[11]用添加叔丁醇的脂肪酶催化生物柴油的转化率达90%以上。而该重组酶在没有有机溶剂的添加下也能达到相同的转化效率，说明该重组酶在无有机溶剂的帮助下可以很好地和底物接触完成反应，有一定的研究和利用价值。
参考文献
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[6] LI L L，DU W，LIU D H，et al.Lipasecatalyzed transesterification of rapeseed oils for biodiesel production with a novel organic solvent as the reaction medium[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2006，43：58-62.
[7] LARA PIZARRO A V，PARK E Y.Lipasecatalyzed production of biodiesel fuel from vegetable oils contained in waste activated bleaching earth[J].Process Biochemistry，2003，38：1077-1082.
[8] ROYON D，DAZ M，ELLENRIEDER G，et al.Enzymatic production of Biodiesel from cotton seed oil using tbutanol as a solvent[J].Bioresource Technology，2007，98：648-653.
[9] NABIL M，ALAIN D C，JOSIANE D C，et al.A conformational transition between an open and closed form of human pancreatic lipase revealed by a monoclonal antibody[J].Biochimica et Biophysica Acta，2000，1476：165-172.
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[11] LI L L，DU W，LIU D H，et al.Lipasecatalyzed transesterification of rapeseed oils for biodiesel production with a novel organic solvent as the reaction medium[J].Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic，2006，43：58-62.